<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ep-patent-document SYSTEM "OpenDataPatent_cz.dtd">
<ep-patent-document lang="en" file="OpendataIPOCZ_PT_DIFF_PUV2015-31689.xml" country="CZ" doc-number="29263" kind="U1">
  <bibliographic-data country="CZ">
    <publication-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>29263</doc-number>
        <kind>U1</kind>
        <date>2016-03-15</date>
      </document-id>
    </publication-reference>
    <classifications-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="1">
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>68</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="2">
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>15</main-group>
        <subgroup>11</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="3">
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>6895</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20180101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20171207</date>
        </action-date>
        <classification-status>R</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
    </classifications-ipcr>
    <classifications-cpc>
      <classification-cpc sequence="1">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>15</main-group>
        <subgroup>11</subgroup>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="2">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>686</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="3">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>6895</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="4">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>2565</main-group>
        <subgroup>00</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>A</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="5">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>2563</main-group>
        <subgroup>107</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>A</classification-value>
        <action-date>
          <date>20160210</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
    </classifications-cpc>
    <application-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>2015-31689</doc-number>
        <date>2015-10-26</date>
      </document-id>
    </application-reference>
    <language-of-filing>cs</language-of-filing>
    <language-of-publication>cs</language-of-publication>
    <priority-claims>
      <priority-claim sequence="1" kind="national">
        <country>CZ</country>
        <date>2015-10-26</date>
      </priority-claim>
    </priority-claims>
    <invention-title lang="CS">Sada pro detekci a identifikaci mykotických patogenů</invention-title>
    <invention-title lang="EN">Kit for detection and identification of mycotic pathogens </invention-title>
  </bibliographic-data>
  <description>
    <p id="p0001" num="0001">Sada pro detekci a identifikaci mykotických patogenů</p>
    <heading>

Oblast techniky</heading>
    <p id="p0002" num="0002">Předkládané technické řešení se týká sady pro detekci a identifikaci mykotických patogenů v klinických vzorcích.</p>
    <heading>

Dosavadní stav techniky</heading>
    <p id="p0003" num="0003">Screening na přítomnost mykotických infekcí metodami molekulární biologie je zásadní pro identifikaci pacientů, kteří vyžadují neprodlené zahájení antimykotické terapie. Velký význam má i negativní výsledek vyšetření, který v kombinaci s výsledky dalších testů, zejména sérolo-gických, může invazivní mykotickou infekci v podstatě vyloučit. Pozitivní přínos má, kromě potvrzení výsledků detekce galaktomannanu a 1,3-beta-D-glukanu, zejména v případě infekcí způsobených vzácnými mykotickými patogeny ( Fusarium sp., Scedosporium sp., a další), které vyžadují specifickou antimykotickou terapii (zejména dle známé primární rezistence na některá antimykotika).</p>
    <p id="p0004" num="0004">V současné době jsou k dispozici na trhu komerční soupravy pro panfungální detekci (např. MycoReal Fungi (Panfungal PCR) LightCycler® 2.0 (Ingenetix) - pro panfungální detekci kvasinek a plísní nebo Mastermix 18S Complete (Molzyme) - opět detekce fungálních patogenů pomocí panfungálních primerů. Většinou jsou tyto soupravy použitelné pouze pro detekci a nikoliv pro identifikaci mykotických patogenů, která je ale často zásadní pro interpretaci výsledků. Sou-prava tudíž neumožňuje přímou identifikaci, je nutná sekvenační reakce. Ne všechny diagnos-tické laboratoře však mají dostupné a zavedené metody sekvenace DNA, tudíž se hledají jiné vhodné alternativy.</p>
    <heading>

Podstata technického řešení</heading>
    <p id="p0005" num="0005">Předkládané technické řešení poskytuje sadu pro detekci a identifikaci mykotických patogenů, která obsahuje primery, navržené tak, aby nasedaly do konzervativních oblastí fungálního genomu (geny pro 5,8S a 28S rRNA), které ohraničují variabilní oblast genomu ITS2 (Obr. 1). Sada dále obsahuje směs pro vysokorozlišovací analýzu křivek tání (High Resolution Melt, HRM) včetně DNA polymerázy a soubor teplot tání DNA jednotlivých kmenů hub ze sbírkových i klinických izolátů. Použité oligonuklotidy slouží k amplifikaci vhodných úseků genomu kvasinek a plísní a HRM směs k následné identifikaci rodů/druhů patogenních mikroorganismů pomocí analýzy křivek tání s vysokým rozlišením. Při tradičním pojetí panfungální polymerázové řetě-zové reakce (Polymerase Chain Reaction, PCR) je etiologické agens infekce identifikováno sek-venací, což vede ke zdržení získání výsledku (většinou alespoň o 48 hodin) a významnému navý-šení nákladů na analýzu. Předkládané technické řešení urychluje analýzu a významně snižuje její náklady.</p>
    <p id="p0006" num="0006">Předmětem předkládaného technického řešení je sada pro detekci a identifikaci mykotických patogenů, která obsahuje alespoň jeden forward primer o sekvenci mající alespoň 90 % identitu se sekvencí 5&apos;-GATGAAGAACGCAGCGAAAT-3&apos; a alespoň jeden reverse primer o sekvenci mající alespoň 90 % identitu se sekvencí 5&apos;-TCCTCCGCTTATTGATAT-3&apos; pro expresi fungálních genů pro 5,8S a 28S rRNA genomu ITS2 metodou polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction, PCR), směs pro vysokorozlišovací analýzu křivek tání (High Resolution Melt, HRM), obsahující fluorescenční barvivo; a soubor teplot tání DNA jednotlivých kmenů hub. 90 % identita zahrnuje například prodloužení nebo zkrácení řetězce o jeden až dva nukleo-tidy. Fluorescenční barvivo pro HRM analýzu je s výhodou vybrané ze skupiny obsahující inter-kalační barviva (např. EvaGreen®, což jsou barviva, která mají nižší úroveň inhibice PCR a zá-roveň zajišťují vyšší senzitivitu reakce než dřívější typy interkalačních barviv). Soubor teplot tání může být ve formě např. tabulky nebo grafu.</p>
    <p id="p0007" num="0007">Ve výhodném provedení obsahuje sada podle předkládaného technického řešení dále DNA polymerázu. DNA polymerázou může být s výhodou hot-start Taq polymeráza.</p>
    <!-- EPO <DP n="2"> -->
    <p id="p0008" num="0008">Výhodou předkládaného technického řešení oproti stavu techniky je umístění nově navržených oligonukleotidů do oblastí ohraničujících variabilní úseky genomu kvasinek a plísní, což umož-ňuje přímou identifikaci etiologického agens. Technické řešení umožňuje používat uzavřený PCR systém s jednokolovou PCR a výsledky jsou dostupné cca za 2 hodiny. Výsledky jednoznačně odliší původce infekce (zejména Aspergillus sp.) od kolonizující/kontaminující bakteriální flóry (zejména Candida sp.). Technické řešení vede k unikátní, rychlé a nízkonákladové metodě detekce mykotických patogenů v klinickém materiálu. Na rozdíl od nemnoha komerčně dostupných řešení není pro identifikaci etiologického agens nutná sekvenace. Sada podle předkládaného technického řešení slouží k rychlému screeningu klinických vzorků a identifikaci patogenních a nepatogenních kvasinek a plísní. Byla rozsáhle validována na širokém panelu kmenů kvasinek a plísní a velkém souboru vzorků bronchoalveolární laváže, které jsou získávány pro určení etiologického agens u pacientů s podezřením na pneumonii způsobenou mykotickými patogeny.</p>
    <p id="p0009" num="0009">Objasnění výkresů</p>
    <heading>

Obr. 1: Schéma nasedání primerů.</heading>
    <p id="p0010" num="0010">Obr. 2: Stanovení teploty tání jako průsečíku kolmice spuštěné z nejvyššího bodu daného píku na osu x.</p>
    <p id="p0011" num="0011">Obr. 3: Křivky tání rodů Candida - C. tropicalis (1), C. parapsilosiss (2), C. glabrata (3), C. albicans (4), C. krusei (5) a Aspeergillus - A. flavus (6), A. niger (7), A. sydowii (8), A. fumigatus (9), A. nidulans (10), A. terreus (11).</p>
    <p id="p0012" num="0012">Obr. 4: Křivky tání dalších klinicky významných plísní - Mucor circinelloides (1), Mucor race-mosus (2), Cryptococcus neoformans (3), Fusarium oxysporum (4), Scedosporium apiospermum (5), Fusarium proliferatum (6), Fusarium solani (7), Trichophyton mentagrophytes (8)</p>
    <p id="p0013" num="0013">Obr. 5. Výsledky detekce fungálních patogenů ve vzorcích bronchoalveolární laváže: - A) pozitivní detekce Aspergillus fumigatus, B) pozitivní detekce Aspergillus flavus, C) pozitivní detekce Candida glabrata a D) negativní vzorek.</p>
    <heading>

Příklady uskutečnění technického řešení</heading>
    <p id="p0014" num="0014">Příklad 1: Testování fungálních kontrol pro zjištění teploty tání jednotlivých druhů</p>
    <p id="p0015" num="0015">Reakční směs (Tabulka 1) byla podrobena PCR amplifikaci a následné HRM analýze za podmínek uvedených v Tabulce 2.
<tables num="">
        <img he="69" wi="155" file="0001.jpg" img-format="jpg" img-content="table" inline="no"/>
      </tables>
      <!-- EPO <DP n="3"> -->
      <tables num="">
        <img he="45" wi="155" file="0002.jpg" img-format="jpg" img-content="table" inline="no"/>
      </tables>
    </p>
    <p id="p0016" num="0016">Analýzy byly provedeny na přístroji Rotorgene 6000 (Corbett Research, Austrálie) pomocí soft-waru Rotor-Gene 6000 series software 1.7. Jako pozitivní byly hodnoceny klinické vzorky, u kterých byl po analýze získán jeden pík (nebo dva píky u C. tropicalis a C. parapsilosis), který překročil threshold dF/dT &gt; 0,5. Sensitivita reakce byla hodnocena na sériovém ředění geno-mické DNA C. albicans, F. solani a A. fumigatus v deionizované vodě. Bylo stanovena citlivost metody 1 fg DNA (C. albicans a F. solani) až 10 fg DNA A. fumigatus. Na Obr. 2 je zobrazen princip hodnocení teplot tání, které proběhlo při tresholdu 0,7. Teplota tání odpovídá průsečíku kolmice spuštěné z nejvyššího bodu daného píku na osu x. Po nastavení tresholdu vyhodnotí program Rotor-Gene 6000 Series Software 1,7 teploty tání automaticky.</p>
    <p id="p0017" num="0017">HRM analýzou bylo otestováno 135 kmenů hub ze sbírkových i klinických izolátů patřících do 40 druhů. Z pozitivních výsledků HRM analýzy byla sestavena tabulka teplot tání (Tabulka 3). Ukázky křivek tání u klinicky významných druhů kvasinek a plísní jsou zobrazeny na Obr. 3 a 4.<!-- EPO <DP n="4"> -->
      <tables num="">
        <img he="203" wi="154" file="0003.jpg" img-format="jpg" img-content="table" inline="no"/>
      </tables>
    </p>
    <p id="p0018" num="0018">Příklad 2: Detekce a identifikace fungálních patogenů ve vzorcích bronchoalveolární laváže</p>
    <p id="p0019" num="0019">Sada pro detekci a identifikaci mykotických patogenů obsahovala SensiFast HRM mix (Bioline), primer MB-F, primer ITS-R, extrahovanou DNA vzorku bronchoalveolární laváže a deionizova-nou vodu. Jako kontrolní vzorek byla použita sada neobsahující extrahovanou DNA. Pro identifikaci fungálních patogenů byl použit soubor teplot tání získaný v Příkladu 1 (Tabulka 3). Reakční směs, obsahující vzorky bronchoalveolární laváže, byla podrobena PCR amplifikaci a následné HRM analýze za podmínek uvedených v Příkladu 1. Výsledky detekce fungálních patogenů ve vzorcích bronchoalveolární laváže jsou vyobrazeny na Obr. 5.</p>
  </description>
  <claims>
    <claim id="c-cs-0001" num="0001">
      <claim-text>

1. Sada pro detekci a identifikaci mykotických patogenů, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden primer o sekvenci mající alespoň 90 % identitu se sekvencí 5&apos;- GATGAAGAACGCAGCGAAAT-3&apos;, alespoň jeden primer o sekvenci mající alespoň 90 % identitu se sekvencí 5&apos;-TCCTCCGCTTATTGATAT-3&apos; pro expresi fungálních genů pro 5,8S a 28S rRNA genomu ITS2 metodou polymerázové řetězové reakce; směs pro vysokorozlišovací analýzu křivek tání, obsahující fluorescenční barvivo, a soubor teplot tání DNA jednotlivých kmenů hub.</claim-text>
    </claim>
    <claim id="c-cs-0002" num="0002">
      <claim-text>

2. Sada podle nároku 1, vyznačená tím, že dále obsahuje DNA polymerázu.</claim-text>
    </claim>
    <!-- EPO <DP n="6"> -->
    <claim id="c-cs-0003" num="0003">
      <claim-text>
        <img he="128" wi="155" file="0004.jpg" img-format="jpg" img-content="drawing" inline="no"/>
      </claim-text>
    </claim>
  </claims>
  <drawings>
    <figure num="">
      <img he="169" wi="146" file="0005.jpg" img-format="jpg" img-content="drawing" inline="no"/>
    </figure>
    <!-- EPO <DP n="8"> -->
    <figure num="">
      <img he="76" wi="136" file="0006.jpg" img-format="jpg" img-content="drawing" inline="no"/>
    </figure>
    <!-- EPO <DP n="9"> -->
    <figure num="">
      <img he="163" wi="134" file="0007.jpg" img-format="jpg" img-content="drawing" inline="no"/>
    </figure>
  </drawings>
</ep-patent-document>
