<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ep-patent-document SYSTEM "OpenDataPatent_cz.dtd">
<ep-patent-document lang="en" file="OpendataIPOCZ_PT_DIFF_PUV2019-36153.xml" country="CZ" doc-number="33033" kind="U1">
  <bibliographic-data country="CZ">
    <publication-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>33033</doc-number>
        <kind>U1</kind>
        <date>2019-07-30</date>
      </document-id>
    </publication-reference>
    <classifications-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="1">
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>00</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20190712</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
    </classifications-ipcr>
    <classifications-cpc>
      <classification-cpc sequence="1">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20170801</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>00</subgroup>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20190712</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
    </classifications-cpc>
    <application-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>2019-36153</doc-number>
        <date>2019-04-26</date>
      </document-id>
    </application-reference>
    <language-of-filing>cs</language-of-filing>
    <language-of-publication>cs</language-of-publication>
    <priority-claims>
      <priority-claim sequence="1" kind="national">
        <country>CZ</country>
        <date>2019-04-26</date>
      </priority-claim>
    </priority-claims>
    <invention-title lang="CS">Živná složka kultivačních médií pro mikroorganismy</invention-title>
    <invention-title lang="EN">Culture media nutrient component for microorganisms</invention-title>
  </bibliographic-data>
  <description id="desc" lang="cs">
    <p num="1">
      <b>Živná složka kultivačních médií pro mikroorganismy</b>
    </p>
    <p num="2"> </p>
    <p num="3"> </p>
    <p num="4">
      <u>Oblast techniky</u>
    </p>
    <p num="5"> </p>
    <p num="6">Technické řešení se týká živné složky médií pro kultivace mikroorganismů v laboratorním i průmyslovém měřítku. Součástí kultivačních médií bývá živná složka, kryjící požadavky mikroorganismů na komplexní zdroje dusíku, jako jsou aminokyseliny, vitamíny a další látky. Přídavek živné složky urychluje kultivaci mikroorganismů a zlepšuje fyziologický stav mikrobiální populace. </p>
    <p num="7"> </p>
    <p num="8"> </p>
    <p num="9">
      <u>Dosavadní stav techniky</u>
    </p>
    <p num="10"> </p>
    <p num="11">Obvyklými živnými složkami kultivačních médií pro mikroorganismy jsou různé typy peptonů, trypton, kvasničný extrakt, kvasničný hydrolyzát, masový výtažek apod. Jedná se o směsi proteinů, jako jsou mléčné nebo sojové bílkoviny, částečné hydrolyzované proteolytickými enzymy, jako je pepsin nebo trypsin, případně o autolyzovanou nebo jinak upravenou biomasu kvasinek nebo extrakty z odpadního masa. Živné složky mohou pro některé, tzv. auxotrofní mikroorganismy pokrývat požadavky na esenciální sloučeniny, jako jsou aminokyseliny nebo vitamíny, které si tyto mikroorganismy nedokážou syntetizovat <i>de novo</i> a v jiných případech se přidávají pro zlepšení a podporu růstu a/nebo produkce žádaných metabolitů jako komplexní zdroj dusíku. Vzhledem k odlišnému složení těchto živných složek jsou při přípravě médií většinou kombinovány minimálně dvě složky v různých vzájemných poměrech. Nevýhodou obvyklých živných složek je jejich vysoká cena, která zvyšuje provozní náklady jak laboratořím, tak průmyslovým výrobám. Jako alternativní zdroj proteinů byl testován odpadní kolagen, kuřecí peří a další živočišné zbytky (např. Taskin M., Kurbanoglu E.B. Evaluation of waste chicken feathers as peptone source for bacterial growth. J. Appl. Microbiol. 111, 826-834 (2011); Vasileva-Tonkova E., Nustorova M., Gushterova A. New protein hydrolysates from collagen wastes used as peptone for bacterial growth. Curr. Microbiol. 54, 54-54 (2007): Canli O., Kurbanoglu E.B. Utilization of ram horn peptone in the production of glucose oxidase by a local isolate <i>Aspergillus niger</i> OC-3. Prep. Biochem Biotechnol. 41, 73-83 (2011)). </p>
    <p num="12"> </p>
    <p num="13">Kombinace levné suroviny a nízkých nákladů na hydrolýzu může zlevnit konečnou cenu živné složky, což je důležité zejména pro biotechnologické výroby biopaliv (etanol, butanol) nebo komoditních chemikálií (mléčná kyselina apod.) </p>
    <p num="14"> </p>
    <p num="15"> </p>
    <p num="16">
      <u>Podstata technického řešení</u>
    </p>
    <p num="17"> </p>
    <p num="18">Předmětem předkládaného technického řešení je živná složka kultivačního média pro mikroorganismy, která sestává z kapalného alkalického hydrolyzátu směsi sestávající z kuřecího peří a z pevného podílu ze zpracování drůbežích zbytků působením enzymu papainu, přičemž poměr kuřecího peří a pevného podílu ze zpracování drůbežích zbytků ve směsi je 1:0,1 až 1:1. </p>
    <p num="19"> </p>
    <p num="20">Živná složka kultivačního média pro mikroorganismy je připravitelná postupem zahrnujícím kroky: </p>
    <p num="21"> </p>
    <p num="22">a)    vytvoření směsi zbytků po strojním oddělení masa s roztokem pufru, výhodně fosfátového pufru o pH 7,57; </p>
    <p num="23"> </p>
    <p num="24">b)    zahřátí směsi, </p>
    <p num="25"> </p>
    <p num="26">c)    enzymatická hydrolýza směsi enzymem papainem, </p>
    <p num="27"> </p>
    <p num="28">d)    inaktivace enzymu, </p>
    <p num="29"> </p>
    <p num="30">e)    separace pevného podílu ze směsi po hydrolýze, </p>
    <p num="31"> </p>
    <p num="32">f)    přidání kuřecího peří tak, že poměr kuřecího peří a pevného podílu z kroku e) ve směsi je 1:0,1 až 1:1, </p>
    <p num="33"> </p>
    <p num="34">g)    alkalická hydrolýza směsi získané v kroku f), </p>
    <p num="35"> </p>
    <p num="36">h)    úprava pH na hodnotu 5,5 až 7,0 přídavkem kyseliny fosforečné a izolace kapalného podílu. </p>
    <p num="37"> </p>
    <p num="38">Kroky a) až e) jsou detailně popsány v patentovém dokumentu CZ 307399. V tomto patentovém dokumentu se získává kapalný podíl jako produkt obsahující bioaktivní látky (kyselinu hyaluronovou, chondroitin sulfát, nízkomolekulární peptidy, volné aminokyseliny). Zbylý pevný podíl lze tedy dále využít pro přípravu živné složky kultivačního média. </p>
    <p num="39"> </p>
    <p num="40">Krok g) lze s výhodou provádět tak, že se směs kuřecího peří a pevného podílu ze zpracování drůbežích zbytků podrobí působení hydroxidu draselného nebo sodného o koncentraci 0,6 až 1 % hmotn. po dobu v rozmezí 12 až 24 h, při teplotě 70 až 90 °C, s výhodou 80 °C. </p>
    <p num="41"> </p>
    <p num="42">Kapalný podíl získaný v kroku h) lze případně dále zahustit, například zahříváním za sníženého tlaku. V jednom provedení lze kapalný podíl zahustit na 1/10 původního objemu odpařením na odparce při teplotě 80 °C a za současného působení vakua. </p>
    <p num="43"> </p>
    <p num="44">Výhodou předkládaného technického řešení je to, že smísením dvou odlišných odpadů bohatých na proteiny a pocházejících z živočišné výroby vznikne heterogenní směs poskytující po zpracování širší spektrum živin, než by poskytovaly po zpracování pouze jednotlivé složky. Další výhodou uvedeného složení je vyšší obsah volných aminokyselin a bioaktivních látek ve výsledném přípravku díky tomu, že v odstředěném pevném podílu ze zpracování drůbežích zbytků na směs bioaktivních látek jsou obsaženy zbytkové koncentrace těchto bioaktivních složek. </p>
    <p num="45"> </p>
    <p num="46">Takto vzniklá živná složka v kapalné formě obsahuje směs rozpustných peptidů a volných aminokyselin současně s fosforečnany v koncentraci neinhibující růst mikroorganismů. Tato živná složka kryje požadavky mikroorganismů na komplexní zdroje dusíku i zdroj fosforu a je dobře využitelná bakteriemi, kvasinkami a plísněmi. Oproti běžným živným složkám je její příprava levnější díky využití surovin, jimiž jsou výhradně odpady generované ve stejné lokalitě. </p>
    <p num="47"> </p>
    <p num="48">Technické řešení dále poskytuje kapalné kultivační médium pro mikroorganismy, které obsahuje živnou složku popsanou výše a vodu nebo pufr. </p>
    <p num="49"> </p>
    <p num="50">Dále technické řešení poskytuje pevné kultivační médium pro mikroorganismy, které obsahuje živnou složku popsanou výše, agar, a popřípadě glukózu. </p>
    <p num="51"> </p>
    <p num="52"> </p>
    <p num="53">
      <u>Příklady uskutečnění technického řešení</u>
    </p>
    <p num="54"> </p>
    <p num="55">Příklad 1 </p>
    <p num="56"> </p>
    <p num="57">Živná složka pro přípravu kultivačního média pro bakterie <i>Escherichia coli</i> se připraví ze směsi kuřecího peří s drůbežími zbytky, získanými jako odstředěný pevný podíl po získání bioaktivních látek postupem podle patentového dokumentu CZ 307 309 (směs obou složek v hmotnostním poměru 1:1). 50 g této směsi se smíchá s 1 l roztoku hydroxidu draselného (koncentrace 1 % hmotn.), a hydroxid se ponechá působit po dobu 24 h při teplotě 80 °C. Poté se pH upraví na hodnotu 6,5 pomocí kyseliny fosforečné, odstředí se nerozpuštěný pevný podíl a kapalný podíl se zahustí na vakuové odparce při teplotě 80 °C na desetinu původního objemu. </p>
    <p num="58"> </p>
    <p num="59">Pro přípravu 1 litru kultivačního média pro bakterie <i>Escherichia coli</i> se použije: </p>
    <p num="60"> </p>
    <p num="61">30 ml živné složky ve formě kapalného koncentrátu, připraveného podle výše uvedeného popisu, se smíchá s 1 l vody a po rozpuštění se pH upraví kyselinou fosforečnou nebo hydroxidem sodným nebo draselným na hodnotu 7,2 až 7.4. </p>
    <p num="62"> </p>
    <p num="63">Před použitím se médium sterilizuje v autoklávu při teplotě 120 °C a tlaku 0,1 MPa po dobu 20 min. Po vychladnutí se médium zaočkuje suspenzí buněk <i>Escherichia coli</i> a kultivace probíhá za požadovaných podmínek. </p>
    <p num="64"> </p>
    <p num="65">Příklad 2 </p>
    <p num="66"> </p>
    <p num="67">Živná složka pro přípravu kultivačního média pro kvasinky <i>Saccharomyces cerevisiae</i> se připraví ze směsi kuřecího peří a drůbežích zbytků, získaných jako odstředěný pevný podíl po získání bioaktivních látek postupem podle CZ patentu č. 307 399 (směs obou složek v hmotnostním poměru 1:1). 40 g směsi se smíchá s 1 l roztoku hydroxidu draselného (koncentrace 0,8 % hmotn.) a hydroxid se nechá působit po dobu 18 h při teplotě 80 °C. Poté se pH upraví na hodnotu 5,5 pomocí kyseliny fosforečné, odstředí se nerozpuštěný pevný podíl a kapalný podíl se zahustí na vakuové odparce při teplotě 80 °C na desetinu původního objemu. </p>
    <p num="68"> </p>
    <p num="69">Pro přípravu 1 litru ztuženého kultivačního média pro kvasinky <i>Saccharomyces cerevisiae</i> se použije: </p>
    <p num="70"> </p>
    <p num="71">50 ml živné složky v podobě kapalného koncentrátu, připraveného podle výše uvedeného popisu 25 g glukosy </p>
    <p num="72">20 g agaru </p>
    <p num="73">a doplní vodou na konečný objem 1 l. </p>
    <p num="74"> </p>
    <p num="75">Po rozpuštění glukosy a suspendaci agaru se upraví pH na 5,5 a před použitím se médium sterilizuje v autoklávu při teplotě 120 °C a tlaku 0,1 MPa po dobu 20 min. Po vychladnutí na teplotu 45 °C se médium rozlije do Petriho misek. Po ztuhnutí ztuženého média v miskách se na povrch agarových ploten zaočkuje suspenze buněk <i>Saccharomyces cerevisiae</i> a rozetře se sterilní hokejkou. Kultivace probíhá za požadovaných podmínek. </p>
  </description>
  <claims id="claim">
    <claim id="c0001" num="0001">
      <claim-text>Živná složka kultivačního média pro mikroorganismy, <b>vyznačující se tím</b>, že sestává z kapalného alkalického hydrolyzátu směsi sestávající z kuřecího peří a z pevného podílu ze zpracování drůbežích zbytků působením enzymu papainu, přičemž poměr kuřecího peří a pevného podílu ze zpracování drůbežích zbytků ve směsi je 1:0,1 až 1:1.<br/>
      </claim-text>
    </claim>
    <claim id="c0002" num="0002">
      <claim-text>Kapalné kultivační médium pro mikroorganismy, <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje živnou složku podle nároku 1 a vodu nebo pufr.<br/>
      </claim-text>
    </claim>
    <claim id="c0003" num="0003">
      <claim-text>Pevné kultivační médium pro mikroorganismy, <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje živnou složku podle nároku 1, agar, a popřípadě glukózu.<br/>
      </claim-text>
    </claim>
  </claims>
</ep-patent-document>
