<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ep-patent-document SYSTEM "OpenDataPatent_cz.dtd">
<ep-patent-document lang="en" file="OpendataIPOCZ_PT_DIFF_PUV2024-41941.xml" country="CZ" doc-number="37959" kind="U1">
  <bibliographic-data country="CZ">
    <publication-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>37959</doc-number>
        <kind>U1</kind>
        <date>2024-06-25</date>
      </document-id>
    </publication-reference>
    <classifications-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="1">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>20</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="2">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>02</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="3">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
    </classifications-ipcr>
    <classifications-cpc>
      <classification-cpc sequence="1">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>12</subgroup>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="2">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>20</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="3">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240619</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
    </classifications-cpc>
    <application-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>2024-41941</doc-number>
        <date>2024-05-03</date>
      </document-id>
    </application-reference>
    <language-of-filing>cs</language-of-filing>
    <language-of-publication>cs</language-of-publication>
    <priority-claims>
      <priority-claim sequence="1" kind="national">
        <country>CZ</country>
        <date>2024-05-03</date>
      </priority-claim>
    </priority-claims>
    <invention-title lang="CS">Osteoinduktivní inkoust s obsahem chitosanu vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk umělých kostí s nastavitelnými mechanickými vlastnostmi</invention-title>
    <invention-title lang="EN">An osteoinductive ink containing chitosan suitable for the low-temperature 3D print of artificial bones with adjustable mechanical properties</invention-title>
  </bibliographic-data>
  <description id="desc" lang="cs">
    <p num="1">
      <b>Osteoinduktivní</b>
      <b> inkoust s obsahem </b>
      <b>chitosanu</b>
      <b> vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk umělých kostí s</b>
      <b> </b>
      <b>nastavitelnými mechanickými vlastnostmi</b>
    </p>
    <p num="2"> </p>
    <p num="3"> </p>
    <p num="4">Oblast techniky </p>
    <p num="5"> </p>
    <p num="6">Předmětem technického řešení je plně vstřebatelný polymer-fosfátový inkoust vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk přesně definovaných kostních implantátů s nastavitelnými mechanickými vlastnostmi, obsahující biokeramickou a polymerní složku modifikovanou biokompatibilním polysacharidem. </p>
    <p num="7"> </p>
    <p num="8"> </p>
    <p num="9">Dosavadní stav techniky </p>
    <p num="10"> </p>
    <p num="11">Již od roku 1958 se v ortopedii používá akrylátový cement na bázi poly(methyl methakrylátu) (PMMA) nejčastěji jako kostní lepidlo pro fixace implantátů nebo jako dočasná či trvalá výplň dutin kostí. Lepení a fixace pomocí PMMA je rychlé a účinné s dobrou mechanickou stabilitou během několika minut. Akrylátové kostní cementy mají kromě výhod, jako jsou dobré manipulační vlastnosti, biointegrita, dobrá biotolerance, vhodné biomechanické vlastnosti a pevnost, také řadu nevýhod – vysokou teplotu polymerace, kdy hrozí nekróza okolní tkáně, vylučování nezreagovaného toxického monomeru nebo smrštění. V dnešní době se upřednostňují injektovatelné degradovatelné kalcium fosfátové kostní cementy (CPC), které mají široké klinické použití jako biokompatibilní a osteokonduktivní kostní cement se schopností tvrdnout in vivo prostřednictvím chemických reakcí za fyziologických podmínek. Současná omezení kalcium fosfátových cementů (CPC) používaných v oblasti regenerace kostí jsou v jejich nízké injektovatelnosti, soudržnosti, rozpadu v tělesných tekutinách (nízká koheze), křehkosti po vytvrzení, pomalé biologické rozložitelnosti a nízké mechanické pevnosti.  </p>
    <p num="12"> </p>
    <p num="13"> </p>
    <p num="14">Podstata technického řešení </p>
    <p num="15"> </p>
    <p num="16">Předmětem předkládaného technického řešení je vstřebatelný kostní inkoust vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk, obsahující biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu (vztaženo na hmotnost práškové matrice), a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru (D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid) (PLGA-PEG-PLGA), kde je při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z pro PEG v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA v rozmezí 6 až 18, přičemž vodný roztok má koncentraci 10 až 30 % hmotn., přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65.  </p>
    <p num="17"> </p>
    <p num="18">Ve výhodném provedení má blokový kopolymer  </p>
    <p num="19">(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid) (PLGA-PEG-PLGA) při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z (PEG) = 34, 2x (LA) = 20,514 a 2y (GA) = 6,038, tj. hmotnostní poměr PLGA/PEG = 2,5 a molární poměr LA/GA = 3,0.  </p>
    <p num="20"> </p>
    <p num="21">Biokompatibilní polymer chitosan má mnoho biologických aktivit jako např. mukoadhezivní, antimikrobiální, protinádorové, protizánětlivé a antioxidační. </p>
    <p num="22"> </p>
    <p num="23">Jako vodné rozpouštědlo pro kapalnou fázi může být použita ultračistá voda Typu I, nebo hypotonické, izotonické a hypertonické roztoky jakou jsou fyziologický roztok (0,9% vodný roztok NaCl), Hartmannův roztok, Ringerův roztok, Hankův roztok, Plasmalyte roztok, Ringerfundin, Darrowův roztok, vodné roztoky s různou iontovou sílou a pH – obecně pufry.  </p>
    <p num="24"> </p>
    <p num="25">Pro zlepšení viskozity a tiskových vlastností výsledné cementové pasty se může do kapalné fáze přidat plastifikátor ve formě polyethylenu glykolu s molekulovou hmotností od 200 do 1000 g/mol v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze nebo jiné emulgační, solubilizační a smáčecí činidlo například na bázi polysorbátu jako jsou polyoxyethylen (20) sorbitan monolaurát (TWEEN 20), polyoxyethylen (40) sorbitan monopalmitát (TWEEN 40), polyoxyethylen (60) sorbitan monostearát (TWEEN 60), polyoxyethylen (65) sorbitan tristearát (TWEEN 65), polyoxyethylen (80) sorbitan monooleát (TWEEN 80).  </p>
    <p num="26"> </p>
    <p num="27">S výhodou je použití tohoto blokového kopolymeru v koncentraci 20 % hmotn. při použití ultračisté vody jako rozpouštědla.  </p>
    <p num="28"> </p>
    <p num="29">S výhodou je přídavek plastifikátoru polyethylen glykolu s molekulovou hmotností 400 g/mol v koncentraci 4 % hmotn. z kapalné fáze. </p>
    <p num="30"> </p>
    <p num="31">Fosforečnan vápenatý může být vybrán ze skupiny: monohydrát dihydrogenfosforečnanu vápenatého (MCPM, Ca(H2PO4)2·H2O, s molárním poměrem C/P = 0,5), bezvodý dihydrogenfosforečnan vápenatý (MCP, Ca(H2PO4)2, C/P = 0,5), dihydrát hydrogenfosforečnanu vápenatého (DCPD, CaHPO4·2H2O, C/P = 1), bezvodý hydrogenfosforečnan vápenatý (DCPA, CaHPO4, C/P = 1), pentahydrát bis(hydrogenfosforečnan)tetrakis(fosforečnanu) oktavápenatého (OCP, Ca8(HPO4)2(PO4)4.5H2O, C/P = 1,33), alfa-trikalciumfosfát (alfa-TCP, α-Ca3(PO4)2, C/P = 1,5), beta- trikalciumfosfát (beta-TCP, β-Ca3(PO4)2, C/P = 1,5), amorfní fosforečnan vápenatý (ACP, CaxHy(PO4)z.nH2O, kde n = 3-4,5, 15−20% H2O, C/P = 1,2-2,2), hydroxyapatit s deficitem vápníku (CDHA, Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x, kde x je mezi 0 a 2, C/P = 1,50-1,67), hydroxyapatit (HA, Ca10(PO4)6(OH)2, C/P = 1,67), fluoroapatit (FA, Ca10(PO4)6F2, C/P = 1,67), oxyapatit (OA, Ca10(PO4)6O, C/P = 1,67), bisfosforečnan-oxid tetravápenatý (TTCP, Ca4(PO4)2O. C/P = 2,0). Pro dané použití má prášková matrice velikost částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů. </p>
    <p num="32"> </p>
    <p num="33">Prášková matrice s výhodou obsahuje čistý alfa-trikalciumfosfát, může obsahovat i beta fázi v poměru 1:4 (alfa:beta) až 1:6. Výhodné je použití velikosti částic menší než 63 mikrometrů.  </p>
    <p num="34"> </p>
    <p num="35">Pro zlepšení mechanických a osteokonduktivních vlastností polymer-fosfátového inkoustu je do inkoustu přidán ve vodě rozpustný částečně deacetylovaný chitin (tj. chitosan) s molekulovou hmotností od 100 (nízkomolekulární) do 300 (vysokomolekulární) kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic ˂ 10 µm. Chitosan se započítává do práškové matrice, ale pro lepší distribuci v připraveném polymer-fosfátovém inkoustu se rozpouští přímo do kapalné fáze před jejím smísením s polymerní matricí. </p>
    <p num="36"> </p>
    <p num="37">Výhodné je použití chitosanu syntetizovaného z krevet P. Borealis s nízkou molekulovou hmotností (130 kDa), stupněm deacetylace 52 % v koncentraci od 1 do 2,5 % hmotn. na práškovou fázi, což odpovídá koncentracím od 0,62 do 1,54 % hmotn. na objem cementové pasty.  </p>
    <p num="38"> </p>
    <p num="39">Po smísení kapalné fáze a práškové matrice pomocí planetárního mixeru při laboratorní teplotě je kostní inkoust připraven pro nízkoteplotní 3D tisk. Hmotnostní poměr kapalné a práškové fáze (L/P) se může pohybovat v rozmezí 0,3 až 0,65. S výhodou pak pro nízkoteplotní 3D tisk je použití poměru L/P v rozmezí 0,55 až 0,65. Takto připravený kostní inkoust má dobu tuhnutí, po kterou s ním lze tisknout, od 20 do 60 minut v závislosti na poměru složení. Viskozita výše uvedených past se pohybuje v rozmezí 200 až 700 Pa.s při smykové rychlosti 5 s-1 (případně 1000 až 2000 Pa.s při smykové rychlosti 1.25 s-1). </p>
    <p num="40"> </p>
    <p num="41">Tisk inkoustu může probíhat pomocí 3D tisku metodou diskontinuální nízkoteplotní extruze. Materiál se při tisku nachází v zásobníku o objemu od 3 do 10 ml. Z tohoto zásobníku je vytlačován pístem, na který je vyvíjen tlak mechanicky vodicím šnekem, nebo pneumaticky. Materiál je vytlačován tryskou o průměru od 250 do 410 µm. Od průměru trysky, viskozity tištěné pasty a rychlosti tisku se odvíjí tlak potřebný k vytlačování materiálu. Ten se pohybuje mezi 80 až 300 kPa. Optimální výška tiskové vrstvy se pohybuje mezi 0,5 až 0,8 násobek průměru vytlačovací trysky. Optimální rychlosti tisku se pohybují od 5 do 15 mm/s. </p>
    <p num="42"> </p>
    <p num="43">Inkoust podle technického řešení je také možné tisknout na komerčních tiskárnách pro 3D bio-tisk jako BioX od firmy Cellink využívající ke 3D tisku tlak vzduchu. Další varianty jsou upravené 3D tiskárny pro extruzi pasty a cementových materiálů, jako Zmorph VX. Pro každou tiskárnu je třeba připravit tiskový model pomocí slicovacích programů, zkráceně slicerů. Ty připraví ovládací kód pro tiskárnu. Většina tiskáren má svůj vlastní slicer, který je od výrobce připraven pro tisk tekutých materiálů, nebo je třeba tyto programy pro tisk tekutých materiálů ručně upravit. Výrobcem připravený slicer je například HearthWare od Cellink, nebo Voxelizer pro tiskárnu Zmorph VX. S výhodou lze využít i open source slicovací programy třetích stran, jako Prusa Slicer. </p>
    <p num="44"> </p>
    <p num="45">Vytištěné vzorky či implantáty se vytvrdí ve vlhkém prostředí nebo vodě. Výsledné vzorky či implantáty mohou mít rozlišnou strukturu danou přesně definovaným uspořádáním mřížky – jednoduchá, gyroid, plástvová struktura s možností nastavení hustoty mřížky od 50 do 100 % u jednoduché a gyroidní struktury a nastavením počtu plástev (jemná, střední, hrubá) ve struktuře. Volbou uvedených parametrů, koncentrací jednotlivých složek a způsobem vytvrzení lze nastavit vhodné mechanické vlastnosti v závislosti na potencionálním použití daného vytisknutého implantátu. Minimální rozměry vzorku jsou od průměru základny 2,0 až 2,5 mm a výšky od 0,2 mm.  </p>
    <p num="46"> </p>
    <p num="47">Vylepšení vlastností kostního materiálu podle technického řešení spočívá v přídavku termosenzitivního, biologicky odbouratelného, tixotropního kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu (PLGA–PEG–PLGA), který podléhá gelovatění za fyziologických podmínek, a v přídavku biokompatibilního, degradovatelného polysacharidu chitosanu s krátkým řetězcem, který vylepší mechanické vlastnosti a může podporovat hojení kostí a osteointegraci 3D tištěných kostních implantátů. </p>
    <p num="48"> </p>
    <p num="49"> </p>
    <p num="50">Příklady uskutečnění technického řešení </p>
    <p num="51"> </p>
    <p num="52">Základní receptura příkladu inkoustu podle technického řešení  </p>
    <p num="53"> </p>
    <p num="54">Polymer-fosfátový inkoust byl připraven smícháním kapalné (L) a práškové (P) fáze v poměru L/P = 0,62. Kapalnou fázi představuje roztok termosenzitivního triblokového kopolymeru na bázi biodegradovatelné kyseliny polymléčné (PLA) a polyglykolové (PGA) a rozpustného poly(ethylen glykolu) (PLGA-PEG-PLGA) o koncentraci 20 % hmotn.. Kopolymer PLGA-PEG-PLGA má při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z (PEG) = 34, 2x (LA) = 20,514 a 2y (GA) = 6,038, tj. hmotnostní poměr PLGA/PEG = 2,5 a molární poměr LA/GA = 3,0. Použitý triblokový kopolymer s teoretickou molekulovou hmotností 5250 g·mol-1 byl připraven při 130 °C polymerací za otevření kruhu pod inertní atmosférou. Jako rozpouštědlo byla použita ultračistá voda Typu II (dle ISO 3696, Milli-Q®). Práškovou matrici představuje komerčně dostupný alfa-trikalciumfosfát (TCP) s velikostí částic &lt;63 µm a nízkomolekulární chitosan (LMWCh, z krevet P. Borealis s nízkou molekulovou hmotností 130 kDa, stupněm deacetylace 52 % a velikostí částic ˂10 µm) o koncentraci 1,8 % hmotn.. Polymer-fosfátový inkoust byl připraven homogenizací pomocí planetárního mixéru, kdy se nejdříve do kapalné fáze roztoku kopolymeru zamíchal chitosan a poté zbývající prášková fáze alfa-TCP. Takto připravený polymer-fosfátový inkoust byl použit ihned k tisku válečků 6x12 mm s jednoduchým uspořádáním mřížky a její hustotou 50 %, pomocí špičky s průměrem 410 µm. Vytištěné válečky byly vytvrzeny v inkubátoru ve vlhkém prostředí (95 %) při 37 °C po dobu 3 dnů. Dále byly připraveny disky 6x2 mm (pro <i>in vitro</i> testování) a 3,5x1 mm (pro <i>in </i>
      <i>vivo</i> testování) s jednoduchým uspořádáním mřížky a její hustotou 50%, pomocí špičky s průměrem 250 µm. Vytištěné disky byly vytvrzeny v inkubátoru ve vlhkém prostředí (95 %) při 37 °C po dobu 3 dnů.  </p>
    <p num="55">
      <br/>
    </p>
    <p num="56">Příklad 1 </p>
    <p num="57"> </p>
    <p num="58">Polymer-fosfátový inkoust i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Základní receptuře. Oproti Základní receptuře je rozdíl v přídavku plastifikátoru TWEEN 80 do kapalné fáze v koncentraci 4 % hmotn..  </p>
    <p num="59"> </p>
    <p num="60">Příklad 2  </p>
    <p num="61"> </p>
    <p num="62">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace, i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Základní receptuře. Oproti Základní receptuře je rozdíl v použití poly(ethylen glykolu) s molekulovou hmotností 400 g/mol (PEG 400) jako plastifikátoru do kapalné fáze v koncentraci 4 % hmotn..  </p>
    <p num="63"> </p>
    <p num="64">Příklad 3 </p>
    <p num="65"> </p>
    <p num="66">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace, i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Základní receptuře. Oproti Základní receptuře je rozdíl v použití poly(ethylen glykolu) s molekulovou hmotností 600 g/mol (PEG 600) jako plastifikátoru do kapalné fáze v koncentraci 4 % hmotn..  </p>
    <p num="67"> </p>
    <p num="68">U Základní receptury a Příkladů 1 až 3 byl sledován vliv plastifikátoru a jeho typu na mechanické vlastnosti v tlaku (kompresi). Mechanické vlastnosti v kompresi byly měřeny pomocí statického testovacího stroje na materiály (Z010 TE Allround-Line, Zwick/Roell) se siloměrem 1 kN a deformační rychlostí 1 mm/min. Tato metoda byla použita pro hodnocení pevnosti v tlaku tištěných vzorků (MPa), která byla vypočítána z poměru standardní síly F (N) a plochy A jednotlivých vzorků (mm2). Výsledky pevnosti v tlaku v závislosti na použitém plastifikátoru jsou znázorněny v Tabulce 1. </p>
    <p num="69"> </p>
    <p num="70">Tabulka 1. Pevnost v tlaku vytvrzených vytištěných válečků 6x12 mm Základní receptuře, Příkladu 1 až 3 s jednoduchým uspořádáním mřížky a hustotu mřížky 50 %. </p>
    <p num="71"> </p>
    <p num="72">
      <tables id="tab0001" num="0001">
        <table>
          <tgroup cols="5">
            <colspec colnum="1" colname="col1" colwidth="1129"/>
            <colspec colnum="2" colname="col2" colwidth="1108"/>
            <colspec colnum="3" colname="col3" colwidth="1296"/>
            <colspec colnum="4" colname="col4" colwidth="1319"/>
            <colspec colnum="5" colname="col5" colwidth="1628"/>
            <tbody>
              <row>
                <entry morerows="2">Příklad</entry>
                <entry morerows="2">Plastifikátor</entry>
                <entry namest="col3" nameend="col5">Pevnost v tlaku (MPa)</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>průměr</entry>
                <entry>medián</entry>
                <entry>odchylka</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad A</entry>
                <entry> - </entry>
                <entry>6,76</entry>
                <entry>6,30</entry>
                <entry>0,99</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 1</entry>
                <entry>TWEEN 80</entry>
                <entry>6,05</entry>
                <entry>6,18</entry>
                <entry>0,60</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 2</entry>
                <entry>PEG 400</entry>
                <entry>6,49</entry>
                <entry>6,38</entry>
                <entry>0,54</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 3</entry>
                <entry>PEG 600</entry>
                <entry>7,78</entry>
                <entry>7,59</entry>
                <entry>0,67</entry>
              </row>
            </tbody>
          </tgroup>
        </table>
      </tables>
    </p>
    <p num="73"> </p>
    <p num="74">Nejvyšší pevnosti v tlaku se statistickou významností ve srovnání s ostatními skupinami vzorků vykazovaly vzorky s plastifikátorem PEG 600 (Příklad 3) s koncentrací 4 % hmotn., kdy medián pevnosti oproti Základní receptuře bez plastifikátoru vzrostl o 20 % z 6,30 na 7,59 MPa. Vzorky s plastifikátorem TWEEN 80 (Příklad 1) a PEG 400 (Příklad 2) měly srovnatelné mechanické vlastnosti s vzorky podle Základní receptury.  </p>
    <p num="75"> </p>
    <p num="76">U Základní receptury a Příkladů 1 až 3 byl pomocí rentgenové práškové difrakce (Rigaku SmartLab 3kW, Rigaku, Japonsko) sledován vliv přídavku a typu plastifikátoru na přeměnu původní práškové fáze (α-TCP) na kalcium-deficitní hydroxyapatit (CDHA) po vytvrzení. Difrakční spektra byla měřena v úhlech od 5° do 50°. Z intenzit vybraných pásů byla určena konverze (stupeň vytvrzení pasty na pevný cement), která je znázorněna v Tabulce 2.  </p>
    <p num="77"> </p>
    <p num="78">Tabulka 2. Procentuální konverze α-TCP na CDHA u vytištěných vzorků bez plastifikátoru (Příklad A) a s použitím různého typu plastifikátoru (Příklad 1až 3).  </p>
    <p num="79"> </p>
    <p num="80">
      <tables id="tab0002" num="0002">
        <table>
          <tgroup cols="3">
            <colspec colnum="1" colname="col1" colwidth="1129"/>
            <colspec colnum="2" colname="col2" colwidth="1418"/>
            <colspec colnum="3" colname="col3" colwidth="2688"/>
            <tbody>
              <row>
                <entry>Příklad</entry>
                <entry>Plastifikátor</entry>
                <entry>Konverze na CDHA (%)</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad A</entry>
                <entry> - </entry>
                <entry>78,6</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 1</entry>
                <entry>TWEEN 80</entry>
                <entry>83,6</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 2</entry>
                <entry>PEG 400</entry>
                <entry>81,7</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 3</entry>
                <entry>PEG 600</entry>
                <entry>75,1</entry>
              </row>
            </tbody>
          </tgroup>
        </table>
      </tables>
    </p>
    <p num="81"> </p>
    <p num="82">Z hodnot je zřejmé, že přídavek a typ plastifikátoru má celkem malý vliv na výslednou konverzi pasty s TCP na cement CDHA. Nejnižší konverzi vykázaly vzorky při použití plastifikátoru PEG 600 (75,1 %), naopak nejvyšší konverze dosáhly vytištěné vzorky s plastifikátorem TWEEN 80 (83,6 %).  </p>
    <p num="83"> </p>
    <p num="84">Závěr: Přídavek plastifikátoru do polymer-fosfátového inkoustu výrazně pozitivně ovlivnil zpracovatelnost (tisknutelnost) připraveného inkoustu a zároveň neovlivnil negativně mechanické ani vytvrzovací vlastnosti inkoustu. Všechny testované plastifikátory jsou pro tisk pasty použitelné.  </p>
    <p num="85"> </p>
    <p num="86">Příklad 4  </p>
    <p num="87"> </p>
    <p num="88">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny stejně jako v případě Příkladu 2 s tím rozdílem, že LMWCh byl přidán v množství 1,0 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="89"> </p>
    <p num="90">Příklad 5  </p>
    <p num="91"> </p>
    <p num="92">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny stejně jako v případě Příkladu 2 s tím rozdílem, že byl LMWCh byl přidán v množství 1,5 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="93"> </p>
    <p num="94">Příklad 6  </p>
    <p num="95"> </p>
    <p num="96">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny jako v případě Příkladu 2 s tím rozdílem, že LMWCh byl přidán v množství 2,0 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="97"> </p>
    <p num="98">Příklad 7  </p>
    <p num="99"> </p>
    <p num="100">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny jako v případě Příkladu 2 s tím rozdílem, že LMWCh byl přidán v množství 2,5 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="101"> </p>
    <p num="102">Příklad 8  </p>
    <p num="103"> </p>
    <p num="104">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny jako v případě Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 byl použit vysokomolekulární chitosan (HMWCh), který byl přidán v množství 1,0 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="105"> </p>
    <p num="106">Příklad 9  </p>
    <p num="107"> </p>
    <p num="108">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny jako v případě Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 byl použit HMWCh, který byl přidán v množství 1,5 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="109"> </p>
    <p num="110">Příklad 10  </p>
    <p num="111"> </p>
    <p num="112">Polymer-fosfátový inkoust a vytištěné vzorky byly připraveny jako v případě Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 byl použit HMWCh, který byl přidán v množství 1,8 % hmotn. z použité práškové fáze.  </p>
    <p num="113"> </p>
    <p num="114">U Příkladu 2 a Příkladů 4-10 byl sledován vliv typu chitosanu (nízkomolekulární nebo vysokomolekulární) a jeho koncentrace na konzistenci a mechanické vlastnosti 3D vytištěných vzorků pomocí špičky o průměru 410 µm ve formě válečku 6x12 mm s hustotou mřížky 50% a jednoduchým uspořádáním mřížky. Mechanické vlastnosti byly měřeny a sledovány stejným postupem jako u předešlých příkladů a výsledky jsou znázorněny v Tabulce 3.  </p>
    <p num="115"> </p>
    <p num="116">Tabulka 3. Pevnost v tlaku vytvrzených vytištěných válečků 6x12 mm s jednoduchým uspořádáním mřížky a hustotou mřížky 50 %, s použitím LMWCh a HMWCh v různých koncentracích (Příklad 4-10). </p>
    <p num="117"> </p>
    <p num="118">
      <tables id="tab0003" num="0003">
        <table>
          <tgroup cols="6">
            <colspec colnum="1" colname="col1" colwidth="1417"/>
            <colspec colnum="2" colname="col2" colwidth="1553"/>
            <colspec colnum="3" colname="col3" colwidth="1531"/>
            <colspec colnum="4" colname="col4" colwidth="935"/>
            <colspec colnum="5" colname="col5" colwidth="951"/>
            <colspec colnum="6" colname="col6" colwidth="1173"/>
            <tbody>
              <row>
                <entry morerows="2">Příklad</entry>
                <entry morerows="2">Chitosan</entry>
                <entry>Koncentrace* </entry>
                <entry namest="col4" nameend="col6">Pevnost v tlaku (MPa)</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>(% hmotn.)</entry>
                <entry>průměr</entry>
                <entry>medián</entry>
                <entry>odchylka</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 4</entry>
                <entry>LMWCh</entry>
                <entry>1,0</entry>
                <entry>5,89</entry>
                <entry>6,35</entry>
                <entry>1,11</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 5</entry>
                <entry>LMWCh</entry>
                <entry>1,5</entry>
                <entry>6,73</entry>
                <entry>6,60</entry>
                <entry>1,11</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 2</entry>
                <entry>LMWCh</entry>
                <entry>1,8</entry>
                <entry>6,79</entry>
                <entry>6,88</entry>
                <entry>0,83</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 6</entry>
                <entry>LMWCh</entry>
                <entry>2,0</entry>
                <entry>5,60</entry>
                <entry>5,50</entry>
                <entry>2,37</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 7</entry>
                <entry>LMWCh</entry>
                <entry>2,5</entry>
                <entry>7,46</entry>
                <entry>7,11</entry>
                <entry>1,13</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 8</entry>
                <entry>HMWCh</entry>
                <entry>1,0</entry>
                <entry>4,94</entry>
                <entry>5,26</entry>
                <entry>0,89</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 9</entry>
                <entry>HMWCh</entry>
                <entry>1,5</entry>
                <entry>9,12</entry>
                <entry>8,94</entry>
                <entry>1,50</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 10</entry>
                <entry>HMWCh</entry>
                <entry>1,8</entry>
                <entry>9,53</entry>
                <entry>9,56</entry>
                <entry>0,87</entry>
              </row>
            </tbody>
          </tgroup>
        </table>
      </tables>
    </p>
    <p num="119">    * Koncentrace je uvedena v % hmotn. z použité práškové fáze </p>
    <p num="120"> </p>
    <p num="121">Z hlediska konzistence polymer-fosfátového inkoustu byl inkoust u Příkladu 4 příliš řídký a neposkytoval požadované vlastnosti pro tisk ve srovnání s ostatními Příklady s vyššími koncentracemi. Mírně rostoucí trend pevnosti v tlaku lze pozorovat u nízkomolekulárního chitosanu (Příklad 4-7), kdy medián pevnosti v tlaku vzrostl z 6,35 MPa (Příklad 4, koncentrace LMWCh 1,0 % hmotn.) až na 7,11 MPa (Příklad 7, koncentrace LMWCh 2,5 % hmotn.).  </p>
    <p num="122"> </p>
    <p num="123">Přírůstek v pevnosti mezi Příkladem 8, Příkladem 9 a Příkladem 10 se vzrůstající koncentrací vysokomolekulárního chitosanu je podstatně významnější, kdy medián pevnosti vzrostl z původních 5,26 MPa pro 1% koncentraci HMWCh (Příklad 8) o 70 % u Příkladu 9 (1,5 % HMWCh) a 82 % u Příkladu 10 (1,8 % HMWCh).  </p>
    <p num="124"> </p>
    <p num="125">Závěr: Z výsledků je patrné, že zvyšující se koncentrace chitosanu pozitivně ovlivňuje mechanické vlastnosti v tlaku. Mechanické vlastnosti u vyšších koncentrací také závisí na typu chitosanu, kdy pevnost v tlaku vzrostla při použití vysokomolekulárního chitosanu v koncentracích 1,5 a 1,8 % hmotn. v průměru o 37 %.  </p>
    <p num="126"> </p>
    <p num="127">Příklad 11  </p>
    <p num="128"> </p>
    <p num="129">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 bylo změněn tvar výsledných vzorků na kvádr.  </p>
    <p num="130">Připravený polymer-fosfátový inkoust byl použit k tisku 8 ks kvádrů s rozměry 6x12 mm s uspořádáním jednoduché mřížky a její hustotou 50 %, pomocí špičky s průměrem 410 µm. Vytištěné kvádry byly vytvrzeny ve vlhkém prostředí při 37 °C po dobu 3 dnů.  </p>
    <p num="131"> </p>
    <p num="132">Příklad 12  </p>
    <p num="133"> </p>
    <p num="134">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 byl změněn tvar výsledných vzorků na kvádr a uspořádání mřížky na formu gyroidu.  </p>
    <p num="135"> </p>
    <p num="136">Připravený polymer-fosfátový inkoust byl použit k tisku 8 ks kvádrů s rozměry 6x12 mm s uspořádáním mřížky ve formě gyroidu a její hustotou 50 %, pomocí špičky s průměrem 410 µm. Vytištěné kvádry byly vytvrzeny v inkubátoru ve vlhkém prostředí (95 %) při 37 °C po dobu 3 dnů.  </p>
    <p num="137"> </p>
    <p num="138">Příklad 13  </p>
    <p num="139"> </p>
    <p num="140">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 byl změněn tvar výsledných vzorků na kvádr a uspořádání mřížky na plástvovou strukturu (honeycomb) s 50% porozitou a násobkem velkostí pórů 1,0x.  </p>
    <p num="141"> </p>
    <p num="142">Připravený polymer-fosfátový inkoust byl použit k tisku 8 ks kvádrů s rozměry 6x6x12 mm s uspořádáním mřížky ve formě plástvové struktury s násobkem 1,0x a její hustotou 50 %, pomocí špičky s průměrem 10 µm. Vytištěné kvádry byly vytvrzeny v inkubátoru ve vlhkém prostředí (95 %) při 37 °C po dobu 3 dnů.  </p>
    <p num="143"> </p>
    <p num="144">Příklad 14  </p>
    <p num="145"> </p>
    <p num="146">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 13 s tím rozdílem, že plástvová struktura (honeycomb) s 50 % porozitou měla násobek velkostí pórů 1,5x. </p>
    <p num="147"> </p>
    <p num="148">Příklad 15  </p>
    <p num="149"> </p>
    <p num="150">Polymer-fosfátový inkoust, koncentrace i samotný tisk a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 13 s tím rozdílem, že plástvová struktura (honeycomb) s 50 % porozitou měla násobek velkostí pórů 2,0x. </p>
    <p num="151"> </p>
    <p num="152">U Příkladů 11 až 15 byl sledován vliv struktury mřížky 3D vytištěných kvádrů na mechanické vlastnosti v tlaku. Mechanické vlastnosti byly měřeny a sledovány stejným postupem jako u předešlých příkladů a výsledky jsou znázorněny v Tabulce 4.  </p>
    <p num="153"> </p>
    <p num="154">Tabulka 4. Pevnost v tlaku vytvrzených vytištěných kvádrů 6x6x12 mm s hustotou mřížky 50 %, s použitím 1,8 LMWCh s různými strukturami mřížky (Příklad 11 až 15). </p>
    <p num="155"> </p>
    <p num="156">
      <tables id="tab0004" num="0004">
        <table>
          <tgroup cols="6">
            <colspec colnum="1" colname="col1" colwidth="1128"/>
            <colspec colnum="2" colname="col2" colwidth="1841"/>
            <colspec colnum="3" colname="col3" colwidth="1133"/>
            <colspec colnum="4" colname="col4" colwidth="1260"/>
            <colspec colnum="5" colname="col5" colwidth="1273"/>
            <colspec colnum="6" colname="col6" colwidth="10"/>
            <tbody>
              <row>
                <entry morerows="2">Příklad</entry>
                <entry morerows="2">Struktura</entry>
                <entry namest="col3" nameend="col6">Pevnost v tlaku (MPa)</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>průměr</entry>
                <entry>medián</entry>
                <entry>odchylka</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 11</entry>
                <entry>jednoduchá</entry>
                <entry>8,35</entry>
                <entry>8,53</entry>
                <entry>1,81</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 12</entry>
                <entry>gyroid</entry>
                <entry>7,16</entry>
                <entry>7,44</entry>
                <entry>1,64</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 13</entry>
                <entry>honeycomb 1,0x</entry>
                <entry>16,23</entry>
                <entry>16,24</entry>
                <entry>3,19</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 14</entry>
                <entry>honeycomb 1,5x</entry>
                <entry>14,93</entry>
                <entry>15,22</entry>
                <entry>2,04</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 15</entry>
                <entry>honeycomb 2,0x</entry>
                <entry>8,60</entry>
                <entry>8,32</entry>
                <entry>1,10</entry>
              </row>
            </tbody>
          </tgroup>
        </table>
      </tables>
    </p>
    <p num="157"> </p>
    <p num="158">Z Tabulky 4 je patrné, že volbou vnitřní struktury tištěných vzorků při zachování 50 % hustoty mřížky lze u implantátů řídit výsledné mechanické vlastnosti pevnosti v tlaku. U uvedených příkladů se medián pevnosti v tlaku pohyboval od 8,32 MPa pro Příklad 15 (honeycomb 2,0x) po 16,24 MPa (příklad 13). Mezi Příkladem 11, Příkladem 12 a Příkladem 15 nebyl statistický významný rozdíl u naměřených mediánů pevnosti v tlaku. Medián pevnosti v tlaku významně vzrostl pro Příklad 14 (honeycomb 1,5 x, 15,22 MPa) a Příklad 13 (honeycomb 1,0x, 16,24 MPa). </p>
    <p num="159">
      <br/>
    </p>
    <p num="160">
      <i>In vitro</i> testování cytotoxicity </p>
    <p num="161"> </p>
    <p num="162">U Základní receptury, Příkladu 2 a Příkladu 10 byl sledován vliv typu chitosanu (nízkomolekulární - Příklad 2 nebo vysokomolekulární - Příklad 10) s koncentrací 1,8 hm% na cytotoxicitu ověřenou pomocí <i>in vitro</i> testů. Velikost testovaných disků byla 6x2 mm (průměr x výška). Jako buněčný model byla použita lidská linie osteoblastů SAOS-2 a cytotoxicita materiálů byla otestována dvěma metodami - měření buněčné viability a barvení buněk viabilní barvou s následnou fotodokumentací.  </p>
    <p num="163"> </p>
    <p num="164">Celá práce probíhala za sterilních podmínek. Buňky lidské linie osteoblastů SAOS-2 (DSMZ, Německo) byly kultivovány v McCoy’s 5A médiu bez fenolové červeně (Merck KGaA, Německo) obsahující 10 % obj. fetálního bovinního séra (Thermo Fisher Scientific, USA), 100 U/l penicilinu, 0.1 mg/ml streptomycinu (Biosera, Francie) a 1% obj. L-glutaminu (Thermo Fisher Scientific). Buňky byly kultivovány při 37°C a 5 % CO2 do 80% konfluence a následně použity na pokus. Použité pasáže buněk se pohybovaly mezi 4 až 7 pasážemi. Sterilní vytisknuté vzorky byly vloženy do 48jamkových kultivačních destiček (Techno Plastic Products, Švýcarsko) a buňky byly na materiály sázeny v počtu 200 000 buněk / vzorek v objemu 20 μl kapky aplikované přímo do 3D struktury vzorku. Po 5 minutách bylo ke vzorkům opatrně přidáno 300 μl kultivačního média a buňky byly kultivovány po dobu 4 hodin při 37 °C a 5 % CO2.  </p>
    <p num="165"> </p>
    <p num="166">Pro měření metabolické aktivity byly vzorky s buňkami vloženy do nových 48jamkových destiček (Techno Plastic Products) a bylo přidáno 500 μl roztoku alamarBlue (Thermo Fisher Scientific) 10x zředěného v kultivačním médiu. Vzorky byly inkubovány 2 h při 37 °C a 5 % CO2 a poté bylo 4× 100 μl pipetováno do černých 96jamkových destiček (Thermo Fisher Scientific) a byla změřena fluorescence při 530 nm (ex) a 590 nm (em) v destičkovém analyzátoru (Synergy HT, Biotek, USA). Každý vzorek byl analyzován v 5 až 8 opakováních. </p>
    <p num="167"> </p>
    <p num="168">Pro vizualizaci živých buněk usazených na vzorcích byly vzorky přemístěny do nových 48jamkových destiček (Techno Plastic Products) a 1x byly opláchnuty PBS. Viabilní barva calcein-AM (Merck) byla 1000× zředěna do kultivačního média bez fenolové červeně a bez fetálního bovinního séra a 300 μl bylo aplikováno na vzorky. Ty byly následně inkubovány 30 min při 37 °C a 5 % CO2 a opláchnuty médiem a mikroskopicky snímány s použitím mikroskopu Olympus IX-83, objektivů UPlanFL N 10×/0.30, Olympus UPlanFL N 20×/0.50 a FITC laseru. Z každého vzorku bylo pořízeno 20 snímků pokrývající celou plochu vzorku a ty byly následně komprimovány v jeden snímek celého vzorku s pomocí SW VisiView (Olympus).  </p>
    <p num="169"> </p>
    <p num="170">Měřením metabolické aktivity bylo ukázáno, že v tomto sledovaném parametru není rozdíl mezi vzorky z Příkladu 2 a Příkladu 10 v porovnání se vzorky z Příkladu A (testováno nepárovým t-testem, p=0,05). Buňky adherované na 3D tištěné materiály zpracovaly viabilní barvu, vykazovaly fluorescenční signál, a tedy jejich životaschopnost byla prokázána i vizuálně.  </p>
    <p num="171"> </p>
    <p num="172">
      <i>In </i>
      <i>vivo</i> testování osteointegrace na modelu laboratorního potkana </p>
    <p num="173"> </p>
    <p num="174">U Příkladu A a Příkladu 2 byla pomocí <i>in </i>
      <i>vivo</i> testování ověřena osteointegrace na modelu laboratorního potkana. Osteointegrace lebečních kostních implantátů byla ověřována na parietální kosti laboratorního potkana a byla prokázána jak bezpečnost implantátů, tak podpora tvorby nové tkáně v defektu. 3D tištěné implantáty byly připraveny dle Příkladu A a Příkladu 2. Velikost implantátů byla uzpůsobena největší možné velikosti defektu v lebce potkana a činila 3,5x1,0 mm (průměr x výška). Jako model pro test osteointegrace byl zvolen model laboratorního potkana, kmene Wistar, samci stáří min. 6 měsíců kvůli dostatečné velikosti kostry. Do pokusu bylo zařazeno 24 kusů zvířat a každé zvíře dostalo 2 implantáty podle předem stanovené randomizace pokusu. Tím bylo možné otestovat celkem 48 vzorků - 2 typy materiálů + kontrola spontánního hojení ve dvou časových bodech a při N = 8 na každou experimentální skupinu. Po uvedení do celkové anestezie byly potkani imobilizovány v přesném stereotaktickém konstruktu, aby nedocházelo ke změně polohy hlavy. Za sterilních podmínek byly potkanům v lebeční parietální kosti provedeny 2 defekty o průměru 3,5 mm každý. Defekty byly vyplněny připravenými 3D tištěnými implantáty. Mezi defekty byly zařazeny i kontroly spontánního hojení, tedy skupina defektů byla ponechána bez výplně. Následně byly rány zašity a ošetření roztokem Novikov. Do 15 min od vyvedení z anestezie zvířata nabyla plného vědomí a následně přijímala potravu a tekutiny ad libitum, tj. operační zákrok neměl na jejich zdravotní stav zásadní negativní vliv. Všechny rány zůstaly až do ukončení pokusu netknuté. Po 3 týdnech a 3 měsících byly pokusy ukončeny a lebeční kosti s defekty v určitých fázích hojení byly explantovány, fotograficky zdokumentovány a ihned vloženy do 4%ního formaldehydu za účelem jejich fixace a úschovy pro následné analýzy. Všechny vzorky byly analyzovány pomocí kvalitativní histologie. Pro každý typ materiálu a každý časový bod bylo provedeno 8 opakování, tj. N = 8 pro každou experimentální skupinu.  </p>
    <p num="175"> </p>
    <p num="176">Histologické hodnocení </p>
    <p num="177"> </p>
    <p num="178">Oba typy vzorků z pokusu byly nejprve podrobeny mikro-CT hodnocení a následně kvalitativní histologické analýze. Po explantaci z usmrceného zvířete byly vzorky 1 měsíc fixovány ve 4% formaldehydu. Následně byly 5 až 8 týdnů odvápňovány roztokem Osteosens (Biognost, Croatia), roztok byl vyměňován 1x týdně. Dostatečná úroveň odvápnění byla ověřena metodou vpichu injekční jehlou. Poté byl vzorek kosti skalpelem okrájen tak, aby kolem hojících se defektů s implantáty byl ještě přibližně 1 mm původní kostní tkáně. Při vizuální kontrole hojících se defektů byly všechny implantáty dobře viditelné a nedošlo k žádným ztrátám. Následně byly vzorky kostí odvodněny rostoucí ethanolovou řadou (70 až 99%), převedeny do xylenu a prosyceny parafínem, vše za pomoci autotechnikonu (Leica, USA). Následovalo zalití vzorků do parafínových bločků pomocí zalévací stanice (Leica, USA). V tomto kroku byla velká pozornost věnována orientaci a poloze vzorku v parafínovém bločku, vzorek byl položen na stojato a vždy musela být zachována pravá a levá strana kvůli různým typům implantátů v defektech a jejich následné identifikaci. Dále byly vzorky nakrájeny na 5 μm řezy pomocí mikrotomu (Leica, USA), nataženy na podložní sklíčko a obarveny základním histologickým přehledným barvením hematoxylin-eosin. Tímto barvením jsme schopni v hojícím se defektu rozlišit novou kost, starou kost, vazivo, imunitní infiltraci a samotný implantát. Barvená sklíčka byla naskenována pomocí skeneru SLIDEVIEW VS200 se softwarem OlyVIA (Olympus, Japonsko).  </p>
    <p num="179"> </p>
    <p num="180">Kvalitativní histologická analýza ukázala, že oba typy vzorků byly prorostlé novou vazivovou tkání a v řadě vzorků tato tkáň kopírovala filamentovou strukturu implantátů, což naznačuje vhodnost 3D struktury implantátů pro podporu hojivého procesu kostních defektů v lebce. Podle fáze hojení bylo možné pozorovat větší či menší ostrůvky novotvořené tkáně přímo v porézní struktuře filament implantátů. Tyto ostrůvky byly často vyživovány nově vytvořenými kapilárami a tkáň byla všude v těsném kontaktu s porézní strukturou implantátů bez známek masivní imunitní infiltrace. Ve většině vzorků byla pozorována tvorba nové kostní hmoty přímo z novotvořené vazivové tkáně. Nová kostní tkáň byla tvořena liniemi osteoblastů, které vycházely přímo z vazivové tkáně. To napovídá tzv. desmodennímu mechanismu tvorby kostní hmoty (tj. z vaziva vzniká rovnou kost bez fáze chrupavky), což je proces typický pro ploché kosti jako je lebka. Defekty, ve kterých probíhalo spontánní hojení, byly vyplněny vazivovou tkání s minimem nové kostní hmoty. V kvalitativním porovnání procesu hojení defektu lebeční kosti se tedy jeví jako přínosné podpořit regeneraci kosti osteoinduktivním 3D tištěným implantátem.  </p>
    <p num="181"> </p>
    <p num="182"> </p>
    <p num="183">Průmyslová využitelnost </p>
    <p num="184"> </p>
    <p num="185">Technické řešení se týká plně vstřebatelného, osteoinduktivního fosfátového kostního cementu s přídavkem chitosanu vhodného pro nízkoteplotní 3D tisk umělých kostí s nastavitelnými mechanickými vlastnostmi obsahující biokeramickou a polymerní složku modifikovanou biokompabilním polysacharidem chitosanem. Tento biokompatibilní osteoinduktivní fosfátový cement je určen pro klinické použití v neurochirurgii, traumatologii či ortopedii např. jako plnohodnotná nekovová náhrada defektu např. při kranioplastice nebo po extrakci nádoru. Hlavním přínosem 3D tištěných implantátů je kromě dostatečné mechanické pevnosti také podpoření procesu osteointegrace, kdy kost může vrůst do tištěného implantátu a zároveň se tištěný implantát začíná vstřebávat. Resorbovaný implantát je nakonec plně nahrazen novou kostí. Tím se eliminují komplikace infekce, expozice implantátu a zajistí se estetické a funkční zlepšení kvality života pacienta. Takto vytištěné implantáty již byly testovány <i>in vitro</i> a <i>in </i>
      <i>vivo</i> s pozitivními výsledky a mohly by tedy být využívány v traumatologických (kranioskopie), ortopedických, a stomatologických oborech v závislosti na typu, tloušťce a velikosti ošetřovaného defektu.  </p>
  </description>
  <claims id="claim">
    <claim num="1">
      <claim-text>Polymer-fosfátový kostní inkoust, 
   <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu s molekulovou hmotností od 100 do 300 kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic menší než 10 mikrometrů, a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru 
   <br/>(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid), obecného vzorce I,(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)-PEG
   <sub>z</sub>-(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>) (I),kde polymerační stupeň z pro PEG je v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA je v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA je v rozmezí 6 až 18,přičemž vodný roztok polymeru má koncentraci 10 až 30 % hmotn.; a přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice se pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="2">
      <claim-text>Polymer-fosfátový kostní inkoust, 
   <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu s molekulovou hmotností od 100 do 300 kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic menší než 10 mikrometrů, a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru 
   <br/>​​​​​​​(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid), obecného vzorce I,(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)-PEG
   <sub>z</sub>-(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>) (I),kde polymerační stupeň z pro PEG je v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA je v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA je v rozmezí 6 až 18,přičemž vodný roztok polymeru má koncentraci 10 až 30 hmotn. %, kde kapalná fáze dále obsahuje plastifikátor ve formě polyethylenu glykolu s molekulovou hmotností od 200 do 1000 g/mol v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze nebo emulgační, solubilizační a smáčecí činidlo na bázi polysorbátu vybraného ze skupiny polyoxyethylen (20) sorbitan monolaurát, polyoxyethylen (40) sorbitan monopalmitát, polyoxyethylen (60) sorbitan monostearát, polyoxyethylen (65) sorbitan tristearát, polyoxyethylen (80) sorbitan monooleát v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze; a přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice se pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65. 
  </claim-text>
    </claim>
  </claims>
</ep-patent-document>
