<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ep-patent-document SYSTEM "OpenDataPatent_cz.dtd">
<ep-patent-document lang="en" file="OpendataIPOCZ_PT_DIFF_PUV2024-41942.xml" country="CZ" doc-number="37960" kind="U1">
  <bibliographic-data country="CZ">
    <publication-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>37960</doc-number>
        <kind>U1</kind>
        <date>2024-06-25</date>
      </document-id>
    </publication-reference>
    <classifications-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="1">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>20</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="2">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>02</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="3">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="4">
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>54</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
    </classifications-ipcr>
    <classifications-cpc>
      <classification-cpc sequence="1">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>20</subgroup>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="2">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>12</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="3">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="4">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>A</section>
        <class>61</class>
        <subclass>L</subclass>
        <main-group>27</main-group>
        <subgroup>54</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240620</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
    </classifications-cpc>
    <application-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>2024-41942</doc-number>
        <date>2024-05-03</date>
      </document-id>
    </application-reference>
    <language-of-filing>cs</language-of-filing>
    <language-of-publication>cs</language-of-publication>
    <priority-claims>
      <priority-claim sequence="1" kind="national">
        <country>CZ</country>
        <date>2024-05-03</date>
      </priority-claim>
    </priority-claims>
    <invention-title lang="CS">Antimikrobiální a hojivý fosfátový kostní inkoust vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk implantátů pro zanícené kostní defekty</invention-title>
    <invention-title lang="EN">An antimicrobial and healing phosphate bone ink suitable for the low temperature 3D print of implants for the inflamed bone defects</invention-title>
  </bibliographic-data>
  <description id="desc" lang="cs">
    <p num="1">
      <b>Antimikrobiální a hojivý fosfátový kostní inkoust vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk implantátů pro zanícené kostní defekty</b>
    </p>
    <p num="2"> </p>
    <p num="3"> </p>
    <p num="4">Oblast techniky </p>
    <p num="5"> </p>
    <p num="6">Předmětem technického řešení je osteoinduktivní plně vstřebatelný polymer-fosfátový inkoust se zvýšenou bioaktivitou pro akcelerovanou regeneraci infekčních kostních defektů. Inkoust obsahující biokeramickou a polymerní složku obsahuje biokompatibilní polysacharid chitosan, a dále obsahuje antimikrobiální a/nebo prohojivé proteiny. Bioaktivní inkoust s proteiny je vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk přesně definovaných kostních implantátů. </p>
    <p num="7"> </p>
    <p num="8"> </p>
    <p num="9">Dosavadní stav techniky </p>
    <p num="10"> </p>
    <p num="11">Již od roku 1958 se v ortopedii používá akrylátový cement na bázi poly(methyl methakrylátu) (PMMA) nejčastěji jako kostní lepidlo pro fixace implantátů nebo jako dočasná či trvalá výplň dutin kostí. Lepení a fixace pomocí PMMA je rychlé a účinné s dobrou mechanickou stabilitou během několika minut. Akrylátové kostní cementy mají kromě výhod, jako jsou dobré manipulační vlastnosti, biointegrita, dobrá biotolerance, vhodné biomechanické vlastnosti a pevnost také i řadu nevýhod, a to vysokou teplotu polymerace, kdy hrozí nekróza okolní tkáně, vylučování nezreagovaného toxického monomeru nebo smrštění.  </p>
    <p num="12"> </p>
    <p num="13">Vhodnou alternativou jsou injektovatelné degradovatelné kalcium fosfátové kostní cementy (CPC), které mají široké klinické použití jako biokompatibilní a osteokonduktivní kostní cement se schopností tvrdnout <i>in </i>
      <i>vivo</i> prostřednictvím chemických reakcí za fyziologických podmínek. Omezení kalcium fosfátových cementů (CPC) používaných v oblasti regenerace kostí jsou v jejich nízké injektovatelnosti, soudržnosti, rozpadu v tělesných tekutinách (nízké koheze), křehkosti po vytvrzení, pomalé biologické rozložitelnosti a nízké mechanické pevnosti.  </p>
    <p num="14"> </p>
    <p num="15">Úskalí léčby zlomeniny, a i fixace implantátu je také v možnosti kontaminace chirurgického místa patogenními bakteriemi nebo vzniku rozsáhlého zánětu, který začíná bezprostředně po zlomenině a trvá několik dní. V oblasti zlomeniny dochází k poškození cév, krvácení, tvorbě hematomů způsobených nekrózou osteocytů v důsledku hypoxie a následné trombóze. V současné době se tyto komplikace řeší přídavkem antibiotik do kostních cementů. V důsledku nadužívání antibiotik a zvyšující se rezistence řady kmeny bakterií je vyvíjen tlak na náhradu antibiotických preparátů jiným typem vhodných antimikrobiálních terapeutik, např. z řady organických bioaktivních látek, proteinů, antibakteriálních enzymů nebo prohojivých růstových faktorů. Tyto látky však zejména nesnášejí zvýšené teploty, a není snadné je inkorporovat do směsí kostních cementů známých dosud. </p>
    <p num="16"> </p>
    <p num="17"> </p>
    <p num="18">Podstata technického řešení </p>
    <p num="19"> </p>
    <p num="20">Předmětem předkládaného technického řešení je vstřebatelný kostní inkoust vhodný pro nízkoteplotní 3D tisk, obsahující biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu (vztaženo na hmotnost práškové matrice), a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru (D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid) (PLGA-PEG-PLGA), kde je při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z pro PEG v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA v rozmezí 6 až 18, přičemž polymer má koncentraci ve vodném roztoku 10 až 30 % hmotn., přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice se pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65, a přičemž kostní inkoust dále obsahuje bioaktivní složku vybranou ze skupiny sestávající z antimikrobiálních enzymů a prohojivých růstových faktorů o koncentraci v rozmezí 0,01 až 1000 mikrogramů/ml.  </p>
    <p num="21"> </p>
    <p num="22">Ve výhodném provedení má blokový kopolymer  </p>
    <p num="23">(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-<i>co</i>-polyglykolid) (PLGA-PEG-PLGA) při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z (PEG) = 34, 2x (LA) = 20,514 a 2y (GA) = 6,038, tj. hmotnostní poměr PLGA/PEG = 2,5 a molární poměr LA/GA = 3,0. </p>
    <p num="24"> </p>
    <p num="25">Biokompatibilní polymer chitosan má mnoho biologických aktivit jako např. mukoadhezivní, antimikrobiální, protinádorové, protizánětlivé a antioxidační. </p>
    <p num="26"> </p>
    <p num="27">Jako vodné rozpouštědlo pro kapalnou fázi může být použita voda, případně další hypotonické, izotonické a hypertonické roztoky jakou jsou fyziologický roztok (0,9% vodný roztok NaCl), Hartmannův roztok, Hankův roztok, Ringerův roztok, Plasmalyte roztok, Ringerfundin, Darrowův roztok, vodné roztoky s různou iontovou silou a pH – obecně pufry.  </p>
    <p num="28"> </p>
    <p num="29">S výhodou je použití tohoto blokového kopolymeru v koncentraci 15 % hmotn. při použití fyziologického roztoku (0,9 % vodný roztok NaCl) jako rozpouštědla.  </p>
    <p num="30"> </p>
    <p num="31">Pro zlepšení viskozity a tiskových vlastností výsledné cementové pasty se může do kapalné fáze přidat plastifikátor polyethylen glykol s molekulovou hmotností od 200 do 1000 g/mol v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze nebo jiné emulgační, solubilizační a smáčecí činidlo například na bázi polysorbátu jako jsou polyoxyethylen (20) sorbitan monolaurát (TWEEN 20), polyoxyethylen (40) sorbitan monopalmitát (TWEEN 40), polyoxyethylen (60) sorbitan monostearát (TWEEN 60), polyoxyethylen (65) sorbitan tristearát (TWEEN 65), polyoxyethylen (80) sorbitan monooleát (TWEEN 80). </p>
    <p num="32"> </p>
    <p num="33">S výhodou je přídavek plastifikátoru polyethylen glykolu s molekulovou hmotností 400 g/mol v koncentraci 3 % hmotn..  </p>
    <p num="34"> </p>
    <p num="35">Pro zlepšení mechanických a osteokonduktivních vlastností polymer-fosfátového inkoustu je do inkoustu přidán ve vodě rozpustný částečně deacetylovaný chitin (tj. chitosan) s molekulovou hmotností od 100 (nízkomolekulární) do 300 (vysokomolekulární) kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic ˂ 10 µm. Chitosan se započítává do práškové matrice, ale pro lepší distribuci v připraveném polymer-fosfátovém inkoustu se rozpouští přímo do kapalné fáze před jejím smísením s polymerní matricí. </p>
    <p num="36"> </p>
    <p num="37">S výhodou je použití chitosanu syntetizovaného z krevet P. Borealis s nízkou molekulovou hmotností (130 kDa), stupněm deacetylace kolem 50 % v koncentraci od 1 do 2,5 % hmotn. na práškovou matrici.  </p>
    <p num="38"> </p>
    <p num="39">Fosforečnan vápenatý může být vybrán ze skupiny: monohydrát dihydrogenfosforečnanu vápenatého (MCPM, Ca(H2PO4)2·H2O, s molárním poměrem C/P = 0,5), bezvodý dihydrogenfosforečnan vápenatý (MCP, Ca(H2PO4)2, C/P = 0,5), dihydrát hydrogenfosforečnanu vápenatého (DCPD, CaHPO4·2H2O, C/P = 1), bezvodý hydrogenfosforečnan vápenatý (DCPA, CaHPO4, C/P = 1), pentahydrát bis(hydrogenfosforečnan)tetrakis(fosforečnanu) oktavápenatého (OCP, Ca8(HPO4)2(PO4)4.5H2O, C/P = 1,33), alfa-trikalciumfosfát (alfa-TCP, α-Ca3(PO4)2, C/P = 1,5), beta- trikalciumfosfát (beta-TCP, β-Ca3(PO4)2, C/P = 1,5), amorfní fosforečnan vápenatý (ACP, CaxHy(PO4)z.nH2O, kde n = 3-4,5, 15−20% H2O, C/P = 1,2-2,2), hydroxyapatit s deficitem vápníku (CDHA, Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x, kde x je mezi 0 a 2, C/P = 1,50-1,67), hydroxyapatit (HA, Ca10(PO4)6(OH)2, C/P = 1,67), fluoroapatit (FA, Ca10(PO4)6F2, C/P = 1,67), oxyapatit (OA, Ca10(PO4)6O, C/P = 1,67), bisfosforečnan-oxid tetravápenatý (TTCP, Ca4(PO4)2O. C/P = 2,0). Pro dané použití má prášková matrice velikost částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů. </p>
    <p num="40">
      <br/>
    </p>
    <p num="41"> </p>
    <p num="42">Prášková matrice s výhodou obsahuje čistý alfa-fosforečnan trivápenatý, může obsahovat i beta fázi v poměru 1:4 (alfa:beta) až 1:6. S výhodou je použití velikosti částic menší než 63 mikrometrů.  </p>
    <p num="43"> </p>
    <p num="44">Pro zvýšení prohojivého a osteokonduktivní účinku kompozitního polymer-fosfátového inkoustu obsahuje inkoust alespoň jeden antimikrobiální enzym a/nebo prohojivý růstový faktor. Antimikrobiální enzymy mohou být z řady proteolytických enzymů (subtiliny, lysostafin, LL-37, bakteriofágy lysinu) nebo enzymů degradujících polysacharidy (lysozym, amyláza, disperzin B, alginát lyáza). Prohojivé růstové faktory mohou být z řady fibroblastových růstových faktorů (FGFs) FGF1 až FGF10 a FGF16 až FGF23, cévních endoteliálních růstových faktorů (VEGF) a kostních morfogenetických proteinů (BMP) z řady od BMP-1 až BMP-8 a BMP-10, BMP-11 a BMP-15 podporujících regeneraci kostí. </p>
    <p num="45"> </p>
    <p num="46">S výhodou je použití antimikrobiálního a bakteriolytického enzymu Lysostaphinu s hmotností 25 kDa, který štěpí zesíťující pentaglycinové můstky v peptidoglykanu bakteriální buněčné stěny, a má antibakteriální účinnost zejména proti epidemiologicky významným sekvenčním typům (ST) <i>Staphylococca</i>
      <i> </i>
      <i>aurea</i> běžně se vyskytujícího u chronických infekcí.  </p>
    <p num="47"> </p>
    <p num="48">S výhodou je použití růstového faktoru fibroblastů 2 (FGF2) - rekombinantního lidského proteinu produkovaného <i>E. coli</i>.  </p>
    <p num="49"> </p>
    <p num="50">Antimikrobiální enzymy a/nebo prohojivé růstové faktory mohou být přidány jak přímo do připraveného kompozitního polymer-fosfátového inkoustu, tak do kapalné fáze nebo pevné matrice před jejich smísením. Jejich koncentrace může být v rozmezí 0,01 až 1000 mikrogramů/ml inkoustu, s tím že v případě růstových faktorů se koncentrace typicky pohybují od 0,01 do 10 mikrogramů/ml inkoustu, a v případě antimikrobiálních enzymů se koncentrace pohybují typicky od 1 to 1000 mikrogramů/ml inkoustu.  </p>
    <p num="51"> </p>
    <p num="52">Antimikrobiální enzymy a/nebo prohojivé růstové faktory mohou být chráněny jak chemicky, tak fyzikálně před změnami pH, teplotou nebo před mechanickým namáháním, které může způsobit okolní matrice, a to enkapsulací (zapouzdřením) do vhodného nosiče. Mezi mnoha dostupnými systémy nosičů jsou nejpoužívanějšími lipidické nanočástice (tzv. liposomy) a polymerní nanočástice (tzv. polymersomy), a to především díky jejich schopnosti zachycovat jak hydrofobní, tak i hydrofilní látky, mezi které patří proteiny a enzymy. Vzhledem k jehličkovité krystalické struktuře vytvrzeného kostního cementu nemusí liposomy poskytovat dostatečnou mechanickou podporu kvůli své snadné deformovatelnosti. Tato vlastnost, i když je výhodná v jiných aplikacích, v případě kostního cementu nemusí přinést požadované výsledky. Proto, využitím vlastností materiálů již obsažených v cementu, lze připravit tzv. core-shell (jádro-obal) polymersomy na bázi triblokového termocitlivého kopolymeru  </p>
    <p num="53">poly(kyselina mléčná-glykolová)–poly(ethyleneglykol)–poly(kyselina mléčná-glykolová) (PLGA–PEG–PLGA) metodou dvojité emulze (voda v oleji ve vodě). Další výhodou těchto částic je možnost regulace rychlosti degradace a uvolňování léčiva podle molekulové hmotnosti triblokového kopolymeru a poměru PEG k PLGA. Efektivně připravené core-shell částice jsou biodegradabilní, biokompatibilní a mají nízkou toxicitu, přičemž účinně chrání aktivní složku a udržují jejich submikronový průměr. </p>
    <p num="54"> </p>
    <p num="55">Po smísení kapalné fáze a práškové matrice při laboratorní teplotě je kostní inkoust připraven pro nízkoteplotní 3D tisk. Poměr kapalné a práškové fáze (L/P) se může pohybovat v rozmezí 0,3 až 0,65. S výhodou pak pro nízkoteplotní 3D tisk je použití poměru L/P v rozmezí 0,55 až 0,65. Takto připravený kostní inkoust má dobu tuhnutí, po kterou s ním lze tisknout, od 20 do 60 minut v závislosti na poměru složení a použitého průměru špičky pro tisk v rozmezí od 250 do 410 µm.  </p>
    <p num="56"> </p>
    <p num="57">Tisk vzorků probíhá pomocí 3D tisku metodou diskontinuální nízkoteplotní extruze. Materiál se při tisku nachází v zásobníku o objemu od 3 do 10 ml. Z tohoto zásobníku je vytlačován pístem, na který je vyvíjen tlak mechanicky vodícím šnekem, nebo pneumaticky. Materiál je vytlačován tryskou o průměru od 250 do 410 µm. Od průměru trysky, viskozity tištěné pasty a rychlosti tisku se odvíjí tlak potřebný k vytlačování materiálu. Ten se pohybuje mezi 80 až 300 kPa. Optimální výška tiskové vrstvy se pohybuje mezi 0,5 až 0,8násobek průměru vytlačovací trysky. Optimální rychlosti tisku se pohybují od 5 do 15 mm/s. </p>
    <p num="58"> </p>
    <p num="59">Inkoust podle technického řešení je také možné tisknout na komerčních tiskárnách pro 3D bio-tisk jako BioX od firmy Cellink využívající ke 3D tisku tlak vzduchu. Další varianty jsou upravené 3D tiskárny pro extruzi pasty a cementových materiálů, jako Zmorph VX. Pro každou tiskárnu je třeba připravit tiskový model pomocí slicovacích programů, zkráceně slicerů. Ty připraví ovládací kód pro tiskárnu. Většina tiskáren má svůj vlastní slicer, který je od výrobce připraven pro tisk tekutých materiálů, nebo je třeba tyto programy pro tisk tekutých materiálů ručně upravit. Výrobcem připravený slicer je například HearthWare od Cellink, nebo Voxelizer pro tiskárnu Zmorph VX. S výhodou lze využít i open source slicovací programy třetích stran, jako Prusa Slicer. </p>
    <p num="60"> </p>
    <p num="61">Vytištěné vzorky či implantáty se vytvrdí ve vlhkém prostředí nebo vodě. Výsledné vzorky či implantáty mohou mít rozlišnou strukturu danou přesně definovaným uspořádáním mřížky – jednoduchá, gyroid, plástvová struktura s možností nastavení hustoty mřížky od 50 do 100 % u jednoduché a gyroidní struktury a nastavením počtu plástev (jemná, střední, hrubá) ve struktuře. Volbou uvedených parametrů, koncentrací jednotlivých složek a způsobem vytvrzení lze nastavit vhodné mechanické vlastnosti v závislosti na potencionálním použití daného vytisknutého implantátu. Minimální rozměry vzorku jsou od průměru základny 2,0 až 2,5 mm a výšky od 0,2 mm.  </p>
    <p num="62"> </p>
    <p num="63">Vylepšení vlastností kostního materiálu podle technického řešení spočívá v přídavku termosenzitivního, biologicky odbouratelného, tixotropního kopolymeru na bázi kyseliny polymléčné, polyglykolové a polyethylenglykolu (PLGA–PEG–PLGA), který podléhá gelovatění za fyziologických podmínek, a v přídavku biokompatibilního, degradovatelného polysacharidu chitosanu s krátkým řetězcem, který vylepší mechanické vlastnosti a může podporovat hojení kostí a osteointegraci 3D tištěných kostních implantátů. </p>
    <p num="64"> </p>
    <p num="65">Kostní inkoust podle technického řešení, vhodný pro nízkoteplotní tisk, je schopen splnit jak vhodné mechanické a biologické požadavky pro implantaci <i>in </i>
      <i>vivo</i>, tak také možnost postupného uvolňování antibakteriálního enzymu nebo prohojivého proteinu, což zabraňuje růstu patogenů nebo napomáhá urychlení regeneračního procesu. Výhodou 3D tisku při nízké teplotě je také v tom, že bioaktivní látky se mohou přidat přímo „in situ“ do připraveného kostního cementu bez ztráty jejich biologické aktivity, protože celý proces probíhá při laboratorní teplotě (tisk) nebo při 37 °C (vytvrzování finálního produktu) a vyloučí se tak nežádoucí podmínky jako je záření (laser nebo UV) nebo vysoké teploty způsobující denaturaci proteinů. </p>
    <p num="66"> </p>
    <p num="67"> </p>
    <p num="68">Příklady uskutečnění technického řešení </p>
    <p num="69"> </p>
    <p num="70">Příklad A – srovnávací příklad </p>
    <p num="71"> </p>
    <p num="72">Referenční polymer-fosfátový inkoust na bázi fosforečnanu vápenatého, nízkomolekulárního chitosanu a termosenzitivního kopolymeru  </p>
    <p num="73"> </p>
    <p num="74">Polymer-fosfátový inkoust byl připraven smícháním kapalné (L) a práškové (P) fáze v poměru L/P = 0,62. Kapalnou fázi představuje roztok termosenzitivního triblokového kopolymeru na bázi degradavatelné kyseliny polymléčné (PLA) a polyglykolové (PGA) a rozpustného poly(ethylen glykolu) (PLGA–PEG–PLGA) o koncentraci 20 % hmotn.. Kopolymer PLGA-PEG-PLGA má při obecném vzorci (PLAx/PGAy)-PEGz-(PLAx/PGAy) polymerační stupeň z (PEG) = 34, 2x (LA) = 20,514 a 2y (GA) = 6,038, tj. hmotnostní poměr PLGA/PEG = 2,5 a molární poměr LA/GA = 3,0. Použitý triblokový kopolymer s teoretickou molekulovou hmotností 5250 g·mol-1 byl připraven při 130 °C polymerací za otevření kruhu pod inertní atmosférou. Jako rozpouštědlo byla použita ultračistá voda Typu II (dle ISO 3696, Milli-Q®). Do kapalné fáze byl přidán plastifikátor poly(ethylen glykol) s molekulovou hmotností 400 g/mol v koncentraci 3 % hmotn. z kapalné fáze, dále byl přidán chitosan a zbývající prášková matrice, tj. komerčně dostupný alfa-fosfát trivápenatý (TCP) s velikostí částic &lt;63 µm a nízkomolekulární chitosan (LMWCh) s koncentrací 1,1 % hmotn. na hmotnost inkoustu, tím byla vytvořena pasta. Takto připravený polymer-fosfátový inkoust, kde chitosan a TCP představují práškovou matrici a roztok kopolymeru a poly(ethylenglykolu) kapalnou fázi, byl použit ihned k tisku disků o velikosti 6×0,35 mm (pro sledování uvolňování), 6×2 mm (pro <i>in vitro</i> testování) a 3,5×1 mm (pro <i>in vitro</i> testování)<i> </i>s jednoduchým uspořádáním mřížky a její hustotou 50 %, pomocí špičky s šířkou 410 µm. Vytištěné disky byly vytvrzeny ve vlhkém prostředí při 37 °C po dobu 3 dnů.  </p>
    <p num="75"> </p>
    <p num="76">Příklad 1  </p>
    <p num="77"> </p>
    <p num="78">Polymer-fosfátový inkoust na bázi fosforečnanu vápenatého, nízkomolekulárního chitosanu a termosenzitivního kopolymeru s přídavkem FGF2 proteinu s koncentrací 1 μg na vzorek </p>
    <p num="79"> </p>
    <p num="80">Polymer-fosfátový inkoust i samotný tisk disků 6×0,35 mm a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu A. Oproti Příkladu A je rozdíl v přídavku roztoku FGF2 proteinu do připravené pasty. Koncentrace FGF2 je volena tak, aby výsledná koncentrace proteinu na jeden vytištěný vzorek byla 1 μg, tedy 0,0005.% hmotn na 1 g pasty. Do práškové fáze bylo přidáno odpovídající množství alfa fosfátu trivápenatého (60 % hmotn. na 1 g pasty) tak, aby výsledný poměr kapalné a práškové fáze odpovídal poměru L/P = 0,62, a došlo tedy ke kompenzaci přídavku roztoku FGF2 proteinu.  </p>
    <p num="81"> </p>
    <p num="82">Příklad 2  </p>
    <p num="83"> </p>
    <p num="84">Polymer-fosfátový inkoust na bázi fosforečnanu vápenatého, nízkomolekulárního chitosanu a termosenzitivního kopolymeru s přídavkem enzybiotika Lysostaphin s koncentrací 10 μg na vzorek  </p>
    <p num="85"> </p>
    <p num="86">Polymer-fosfátový inkoust i samotný tisk disků 6x0,35 mm a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu A. Oproti Příkladu A je rozdíl v přídavku antibakteriálního roztoku protinu (enzymu) Lysostaphinu do připravené pasty. Koncentrace Lysostaphinu je volena tak, aby výsledná koncentrace enzybiotika na jeden vytištěný vzorek byla 10 μg, tedy 0,005 % hmotn. na 1 g pasty. Do práškové fáze bylo přidáno odpovídající množství alfa-TCP (60 % hmotn. na 1 g pasty) tak, aby výsledný poměr kapalné a práškové fáze odpovídal poměru L/P = 0,62, a došlo tedy ke kompenzaci přídavku roztoku enzybiotika.  </p>
    <p num="87"> </p>
    <p num="88">Příklad 3  </p>
    <p num="89"> </p>
    <p num="90">Polymer-fosfátový inkoust na bázi fosforečnanu vápenatého, nízkomolekulárního chitosanu a termosenzitivního kopolymeru s přídavkem enkapsulovaného proteinu FGF2 s koncentrací 1 μg na vzorek.<b> </b>
    </p>
    <p num="91"> </p>
    <p num="92">Polymer-fosfátový inkoust i samotný tisk disků 6×0,35 mm a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 1. Oproti Příkladu 1 je rozdíl v přídavku roztoku enkapsulovaného FGF2 proteinu. Prohojivý FGF2 protein byl enkapsulován do core-shell částic založených na kopolymeru PLGA–PEG–PLGA připravených metodou dvojité emulze, voda v oleji ve vodě. Koncentrace polymeru na formulaci byla 1,67 mg/ml v ultračisté vodě. Nanočástice použité pro vmíchání do pasty měly průměr 201,5 ± 25,9 nm a enkapsulační efektivitu (EE) 40,2 %. Koncentrace enkapsulovaného FGF2 je volena tak, aby výsledná koncentrace proteinu na jeden vytištěný vzorek byla 1 μg, tedy 0,0005 % hmotn. na 1 g pasty. Do práškové fáze bylo přidáno odpovídající množství alfa-TCP (60 % hmotn. na 1 g pasty) tak, aby výsledný poměr kapalné a práškové fáze odpovídal poměru L/P = 0,62, a došlo tedy ke kompenzaci přídavku enkapsulovaného FGF2 proteinu.  </p>
    <p num="93"> </p>
    <p num="94">Příklad 4  </p>
    <p num="95"> </p>
    <p num="96">Polymer-fosfátový inkoust na bázi fosforečnanu vápenatého, nízkomolekulárního chitosanu a termosenzitivního kopolymeru s přídavkem enkapsulovaného enzybiotika Lysostaphin s koncentrací 10 μg na vzorek </p>
    <p num="97"> </p>
    <p num="98">Polymer-fosfátový inkoust i samotný tisk disků 6x0,35 mm a vytvrzení jsou založeny na složení a postupech jako v Příkladu 2. Oproti Příkladu 2 je rozdíl v přídavku roztoku enkapsulovaného enzybiotika Lysostaphin. Antibaktriální Lysostaphin byl enkapsulován stejným způsobem jako prohojivý FGF2 v Příkladu 3. Nanočástice použité pro vmíchání do pasty měly průměr 177,3 ± 12,9 nm a EE 98,6 %. Koncentrace enkapsulovaného Lysostaphinu je volena tak, aby výsledná koncentrace enzybiotika na jeden vytištěný vzorek byla 10 μg, tedy 0,0005 % hmotn. na 1 g pasty. Do práškové fáze bylo přidáno odpovídající množství alfa-trikalcium fosfátu (60 % hmotn. na 1 g pasty) tak, aby výsledný poměr kapalné a práškové fáze odpovídal poměru L/P = 0,62, a došlo tedy ke kompenzaci přídavku enkapsulovaného enzybiotika Lysostaphin.  </p>
    <p num="99"> </p>
    <p num="100">U všech příkladů bylo sledováno uvolňování FGF2 proteinu a antibakteriálního enzymu Lysostaphin. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1. Uvolňování bylo sledováno pomocí nepřímé imunoenzymatické reakce (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay). Na 96jamkovou mikrotitrační destičku byly naneseny vzorky z kalibrační řady proteinu a roztoky výluhů, které byly získány odběry v intervalech 3 h, 1, 2, 3, 7, 14, 21 a 28 dní v technickém duplikátu. Analýza byla provedena v následujících krocích: vzorek - blokační pufr - primární protilátka - sekundární protilátka - TMB substrát - zastavovací roztok. Mezi každým krokem byly jamky promyty promývacím PBST pufrem (fosfátový pufr PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,2 a 0,05 obj. % Tween-20). Jako blokační pufr pro detekci FGF2 byl použit 1% (hm./obj.) roztok bovinního albuminu v PBST, pro detekci Lysostaphinu byl použit 3% (hm./obj.) roztok kaseinu v PBST. Po přídavku TMB substrátu (TMB-complete 2, TestLine Clinical Diagnostics s.r.o., ČR) byla reakce ukončena roztokem 1 M H2SO4. Na vzorcích byla změřena absorbance za pomocí plate-readeru (BioTek, Agilent Technologies, USA) při vlnové délce zdroje 450 nm.  </p>
    <p num="101"> </p>
    <p num="102">Pro detekci FGF2 byla použita kombinace: primární antigen, monoklonální myší FGF2 (G-2) (sc-365106, Santa Cruz Biotechnology, USA) a sekundární antigen kozí anti-myší IgG-peroxidáza Ab (A5278, Sigma, USA). Pro detekci Lysostaphinu byla použita kombinace: primární antigen, monoklonální myší IgG2b (MA1-21315,<b> </b>6×-His Tag Monoclonal Antibody, Thermo Fisher Scientific, Česká republika) a sekundární antigen kozí anti-myší IgG (H+L) peroxidáza (62-6520, Thermo FIsher Scientific, Česká republika) Absorbance vzorků byla vypočtena pomocí lineárních kalibračních křivek, které byly výsledkem absorbancí vzorků kalibrační řady (stanoveno pro každou mikrotitrační destičku zvlášť). Kalibrační řada pro FGF2 byla v rozmezí od 40 až 320 ng/ml proteinu v pufru (150 mM NaCl, 20 mM fosfátový pufr, pH 7,5); pro Lysostaphin pak byla kalibrační řada v rozmezí od 66,2 až 2500 ng/ml proteinu v pufru (150 mM NaCl, 20 mM fosfátový pufr, pH 7,5).  </p>
    <p num="103">
      <br/>
    </p>
    <p num="104">Tabulka 1: Množství uvolněného FGF2 a Lysostaphinu. </p>
    <p num="105"> </p>
    <p num="106">
      <tables id="tab0001" num="0001">
        <table>
          <tgroup cols="6">
            <colspec colnum="1" colname="col1" colwidth="1125"/>
            <colspec colnum="2" colname="col2" colwidth="1455"/>
            <colspec colnum="3" colname="col3" colwidth="1380"/>
            <colspec colnum="4" colname="col4" colwidth="1440"/>
            <colspec colnum="5" colname="col5" colwidth="1488"/>
            <colspec colnum="6" colname="col6" colwidth="12"/>
            <tbody>
              <row>
                <entry morerows="2">Čas (dny)</entry>
                <entry namest="col2" nameend="col5">Kumulativní uvolnění (%)</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>Příklad 1</entry>
                <entry>Příklad 2</entry>
                <entry>Příklad 3</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">Příklad 4</entry>
              </row>
              <row>
                <entry/>
                <entry>FGF2</entry>
                <entry>Lysostaphin</entry>
                <entry>FGF2</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">Lysostaphin</entry>
              </row>
              <row>
                <entry/>
                <entry>zamíchaný do pasty</entry>
                <entry>zamíchaný do pasty</entry>
                <entry>zamíchaný do pasty</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">zamíchaný do pasty</entry>
              </row>
              <row>
                <entry/>
                <entry>čistý</entry>
                <entry>čistý</entry>
                <entry>enkapsulovaný</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">enkapsulovaný</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>EE (%)</entry>
                <entry/>
                <entry/>
                <entry>40,18 ± 0,22</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">98,65 ± 7,18</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>CE(%)</entry>
                <entry/>
                <entry/>
                <entry/>
                <entry namest="col5" nameend="col6"/>
              </row>
              <row>
                <entry>0,125</entry>
                <entry>0,56 ± 0,08</entry>
                <entry>4,54 ± 1,99</entry>
                <entry>0,75 ± 0,29</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">5,40 ± 2,81</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>1</entry>
                <entry>0,79 ± 0,15</entry>
                <entry>12,00 ± 2,37</entry>
                <entry>1,04 ± 0,22</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">11,48 ± 4,02</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>2</entry>
                <entry>0,95 ± 0,09</entry>
                <entry>16,27 ± 2,53</entry>
                <entry>3,14 ± 2,28</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">16,00 ± 4,39</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>3</entry>
                <entry>1,17 ± 0,03</entry>
                <entry>19,68 ± 2,58</entry>
                <entry>9,64 ± 5,38</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">23,21 ± 8,32</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>7</entry>
                <entry>1,41 ± 0,20</entry>
                <entry>26,63 ± 3,29</entry>
                <entry>13,87 ± 1,90</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">30,39 ± 13,94</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>14</entry>
                <entry>1,70 ± 0,32</entry>
                <entry>31,16 ± 4,64</entry>
                <entry>14,49 ± 1,93</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">37,20 ± 15,69</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>21</entry>
                <entry>2,16 ± 0,28</entry>
                <entry>33,42 ± 4,52</entry>
                <entry>15,35 ± 2,62</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">41,52 ± 13,55</entry>
              </row>
              <row>
                <entry>28</entry>
                <entry>2,37 ± 0,16</entry>
                <entry>35,17 ± 5,50</entry>
                <entry>15,46 ± 2,62</entry>
                <entry namest="col5" nameend="col6">43,94 ± 12,02</entry>
              </row>
            </tbody>
          </tgroup>
        </table>
      </tables>
    </p>
    <p num="107"> </p>
    <p num="108">U Příkladu 1 a Příkladu 3 byl sledován vliv enkapsulace FGF2 proteinu na uvolňování z cementové pasty. U Příkladu 3 bylo oproti Příkladu 1 zaznamenáno výrazně vyšší množství uvolněného proteinu ve sledovaných časech ve srovnání s Příkladem 1. Významnější rozdíl v množství uvolněného FGF2 nastal po 2 dnech sledování, jak ukazuje Tabulka 1, kdy došlo k výraznému nárůstu uvolněného proteinu u Příkladu 3 v porovnání s Příkladem 1. Protein se v případě Příkladu 3 uvolňoval mechanismem prvního řádu. Celkové naměřené množství po 28 dnech činilo 2,37 ± 0,16 % u Příkladu 1 a 15,46 ± 2,62 % u Příkladu 3. Tento rozdíl byl způsoben tím, FGF2 byl u Příkladu 3 dodatečně chráněn kapslí PLGA–PEG–PLGA ve formě “core-shell” částic. Vzhledem k jehličkovité struktuře (CDHA fáze) vytvrzeného cementu nebylo u Příkladu 3 blokováno uvolňování FGF2 z implantátu ve srovnání s Příkladem 1, kdy došlo k uvolnění velmi nízkého množství proteinu v důsledku mechanického bránění.  </p>
    <p num="109"> </p>
    <p num="110">U Příkladu 2 a Příkladu 4 byl zkoumán efekt enkapsulace enzymu Lysostaphin na jeho uvolňování z cementové matrice. V Příkladu 4 bylo zjištěno, že celkové množství uvolněného proteinu bylo ve sledovaných časových úsecích výrazně vyšší ve srovnání s Příkladem 2. Podle údajů z Tabulky 1, významný rozdíl mezi Příkladem 4 a Příkladem 2 byl patrný již po 2 dnech, kdy se enzym uvolňoval podle kinetiky prvního řádu. V Příkladu 4 došlo do 2. dne k uvolnění pouze části celkové dávky enzymu, následované druhou fází uvolňování, která pokračovala až do 28. dne, přičemž bylo uvolněno 43,94 ± 12,02 % celkově enkapsulovaného enzymu. Naproti tomu, v Příkladu 2 bylo po 28 dnech uvolněno 35,17 ± 5,50 % celkově dávkovaného množství enzymu. Příklad 4 efektivně demonstruje přínos “core-shell” částic založených na PLGA–PEG–PLGA, které nejenže chrání enzym před vnějšími vlivy, ale také zlepšují jeho postupné uvolňování z cementových matric. </p>
    <p num="111"> </p>
    <p num="112"> </p>
    <p num="113">Průmyslová využitelnost </p>
    <p num="114"> </p>
    <p num="115">Technické řešení se týká osteoinduktivního plně vstřebatelného, polymer-fosfátového kostního inkoustu vhodného pro nízkoteplotní 3D tisk a modifikovaného biokompatibilním polysacharidem se zvýšenou bioaktivitou zahrnující antimikrobiální a prohojivé proteiny.  </p>
    <p num="116"> </p>
    <p num="117">Tento biokompatibilní osteoinduktivní fosfátový inkoust je určen pro klinické použití v neurochirurgii, traumatologii či ortopedii např. jako plnohodnotná nekovová náhrada defektu např. při kranioplastice nebo po extrakci nádoru, případně při infekcích kostí vzniklých po implantaci endoprotézy. Hlavním přínosem 3D tištěných implantátů je kromě dostatečné mechanické pevnosti také podpoření procesu osteointegrace, kdy kost může vrůst do tištěného implantátu a zároveň se tištěný implantát začíná vstřebávat. Dále materiál díky prohojivým proteinům akceleruje osseintegraci a celkovou regeneraci kosti a také díky antibakteriálnímu enzymu zabraňuje, případně potlačuje růst patogenních bakterií a tím umožňuje opět rychlejší regeneraci kosti. </p>
    <p num="118"> </p>
    <p num="119">Resorbovaný implantát je nakonec plně nahrazen novou kostí. Tím se eliminují komplikace infekce, expozice implantátu a zajistí se estetické a funkční zlepšení kvality života pacienta. Takto vytištěné implantáty již byly testovány in vitro a in vivo s pozitivními výsledky a mohly by tedy být využívány v traumatologických (kranioskopie), ortopedických, a stomatologických oborech v závislosti na typu, tloušťce a velikosti ošetřovaného defektu.  </p>
  </description>
  <claims id="claim">
    <claim num="1">
      <claim-text>Polymer-fosfátový kostní inkoust, 
   <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu s molekulovou hmotností od 100 do 300 kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic menší než 10 mikrometrů, a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru
   <br/>(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid) 
   <br/>obecného vzorce I,(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)-PEG
   <sub>z</sub>-(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)  (I),kde polymerační stupeň z pro PEG je v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA je v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA je v rozmezí 6 až 18,přičemž vodný roztok polymeru má koncentraci 10 až 30 % hmotn.; přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice se pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65, a přičemž kostní inkoust dále obsahuje bioaktivní složku vybranou ze skupiny sestávající z antimikrobiálních enzymů a prohojivých růstových faktorů v množství v rozmezí 0,01 až 1000 mikrogramů na ml inkoustu.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="2">
      <claim-text>Polymer-fosfátový kostní inkoust, 
   <b>vyznačující se tím</b>, že obsahuje biokeramickou práškovou matrici zahrnující fosforečnan vápenatý s velikostí částic v rozmezí 5 až 200 mikrometrů a 1 až 3 % hmotn. chitosanu s molekulovou hmotností od 100 do 300 kDa se stupněm deacetylace od 40 do 60 % a velikostí částic menší než 10 mikrometrů, a kapalnou fázi, kterou je vodný roztok blokového kopolymeru
   <br/>​​​​​​​(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid)-b-polyethylenglykol-b-(D,L-polylaktid-
   <i>co</i>-polyglykolid) 
   <br/>​​​​​​​obecného vzorce I,(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)-PEG
   <sub>z</sub>-(PLA
   <sub>x</sub>/PGA
   <sub>y</sub>)  (I),kde polymerační stupeň z pro PEG je v rozmezí 22 až 35, polymerační stupeň 2x pro LA je v rozmezí 16 až 41 a polymerační stupeň 2y pro GA je v rozmezí 6 až 18,přičemž vodný roztok polymeru má koncentraci 10 až 30% hmotn., kde kapalná fáze dále obsahuje plastifikátor ve formě polyethylenu glykolu s molekulovou hmotností od 200 do 1000 g/mol v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze nebo emulgační, solubilizační a smáčecí činidlo na bázi polysorbátu, kterými jsou polyoxyethylen (20) sorbitan monolaurát, polyoxyethylen (40) sorbitan monopalmitát, polyoxyethylen (60) sorbitan monostearát, polyoxyethylen (65) sorbitan tristearát, polyoxyethylen (80) sorbitan monooleát v koncentraci od 2 do 6 % hmotn. z kapalné fáze; přičemž hmotnostní poměr kapalné fáze a práškové matrice se pohybuje v rozmezí 0,3 až 0,65, a přičemž kostní inkoust dále obsahuje bioaktivní složku vybranou ze skupiny sestávající z antimikrobiálních enzymů a prohojivých růstových faktorů v množství v rozmezí 0,01 až 1000 mikrogramů na ml inkoustu.
  </claim-text>
    </claim>
  </claims>
</ep-patent-document>
