<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ep-patent-document SYSTEM "OpenDataPatent_cz.dtd">
<ep-patent-document lang="en" file="OpendataIPOCZ_PT_DIFF_PUV2024-41991.xml" country="CZ" doc-number="37961" kind="U1">
  <bibliographic-data country="CZ">
    <publication-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>37961</doc-number>
        <kind>U1</kind>
        <date>2024-06-25</date>
      </document-id>
    </publication-reference>
    <classifications-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="1">
        <section>G</section>
        <class>01</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>21</main-group>
        <subgroup>65</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240610</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
      <classification-ipcr sequence="2">
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <ipc-version-indicator>
          <date>20060101</date>
        </ipc-version-indicator>
        <classification-level>A</classification-level>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240610</date>
        </action-date>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
      </classification-ipcr>
    </classifications-ipcr>
    <classifications-cpc>
      <classification-cpc sequence="1">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>G</section>
        <class>01</class>
        <subclass>N</subclass>
        <main-group>21</main-group>
        <subgroup>65</subgroup>
        <symbol-position>F</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240610</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="2">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>M</subclass>
        <main-group>23</main-group>
        <subgroup>16</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240610</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
      <classification-cpc sequence="3">
        <cpc-version-indicator>
          <date>20130101</date>
        </cpc-version-indicator>
        <section>C</section>
        <class>12</class>
        <subclass>Q</subclass>
        <main-group>1</main-group>
        <subgroup>18</subgroup>
        <symbol-position>L</symbol-position>
        <classification-value>I</classification-value>
        <action-date>
          <date>20240610</date>
        </action-date>
        <generating-office>
          <country>CZ</country>
        </generating-office>
        <classification-status>B</classification-status>
        <classification-data-source>H</classification-data-source>
      </classification-cpc>
    </classifications-cpc>
    <application-reference>
      <document-id>
        <country>CZ</country>
        <doc-number>2024-41991</doc-number>
        <date>2024-05-28</date>
      </document-id>
    </application-reference>
    <language-of-filing>cs</language-of-filing>
    <language-of-publication>cs</language-of-publication>
    <priority-claims>
      <priority-claim sequence="1" kind="national">
        <country>CZ</country>
        <date>2024-05-28</date>
      </priority-claim>
    </priority-claims>
    <invention-title lang="CS">Mikrofluidní čip a analytická sestava pro charakterizaci a identifikaci mikrobů pomocí optických detekčních metod</invention-title>
    <invention-title lang="EN">A microfluidic chip and an analytic assembly for the characterization and identification of microbes using optical detection methods</invention-title>
  </bibliographic-data>
  <description id="desc" lang="cs">
    <p num="1">
      <b>Mikrofluidní čip a a</b>
      <b>nalytická sestava</b>
      <b> pro charakterizaci a identifikaci mikrobů</b>
      <b> </b>
      <b>pomocí optických detekčních metod</b>
    </p>
    <p num="2"> </p>
    <p num="3"> </p>
    <p num="4">Oblast techniky </p>
    <p num="5"> </p>
    <p num="6">Technické řešení se týká mikrofluidního čipu a analytické sestavy pro charakterizaci a identifikaci mikrobů. Lze ji využít pro měření vlivu antibiotik na baktérie, pro uchovávání bakterií v mikrokomůrkách a k měření jejich vitality prostřednictvím různých detekčních metod (např. fluorescence, ramanovské spektroskopie, atd.). Uvedenou sestavu je tedy možné připojit například k Ramanovu spektrometru. </p>
    <p num="7"> </p>
    <p num="8"> </p>
    <p num="9">Dosavadní stav techniky </p>
    <p num="10"> </p>
    <p num="11">Rychlá a přesná identifikace patogenů je jednou z největších výzev medicíny. Včasná identifikace bakterií a jejich antimikrobiální rezistence by zjednodušila a zefektivnila nasazení odpovídající léčby infekcí, čímž by snížila náklady na zdravotní péči, výrazně pomohla zmírnit problém s narůstající antimikrobiální rezistenci, a především v mnoha případech by pomohla zachránit životy. </p>
    <p num="12"> </p>
    <p num="13">Zlatý standard diagnostiky u většiny infekcí vychází z kultivace na agarových plotnách a/nebo hemokultur v automatizovaných systémech (pro infekce krevního řečiště). Rutině následuje biochemická identifikace a fenotypová charakterizace profilu citlivosti/rezistence k antimikrobiálním látkám. Čas potřebný pro identifikaci je mezi 48 hodinami až několika dny (pro pomalu rostoucí mikroby). </p>
    <p num="14"> </p>
    <p num="15">Existují i sérologické a/nebo imunochromatografické metody, které jsou vysoce specifické a mohou být použity pro potvrzení/vyloučení přítomnosti určitých mikrobů. </p>
    <p num="16"> </p>
    <p num="17">V posledních dekádách dochází k mnoha snahám o zrychlení procesu klinické diagnostiky různými metodami. Přelomem byl nástup hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry), která je rychlá, efektivní a relativně levná metoda založená na fingerprintingu proteinů v mikrobiálních buňkách. Avšak i u MALDI-TOF MS je pro přesnou identifikaci krok kultivace potřebný a využívá poměrně nákladný spotřební materiál. </p>
    <p num="18"> </p>
    <p num="19">Oproti molekulárně-biologickým metodám (které také možno využít pro diagnostiku z malých objemů vzorků) ponechává Ramanova spektrometrie buňky živé, co umožňuje jejich další testování. Příprava vzorku je jednoduchá a rychlá, nevyžaduje nutně nákladný spotřební materiál. </p>
    <p num="20"> </p>
    <p num="21">Zavedení dodatečného zdroje záření v technikách mikroskopie lze využít například k excitaci fluorescence, k fotopolymeracím, k laserovému řezání biologických preparátů a také k vytváření fokusovaných zářivých polí pro manipulaci s částicemi (např. viry a bakteriemi). </p>
    <p num="22"> </p>
    <p num="23">Jedním ze zařízení, které lze použít pro zavedení dodatečného zdroje záření kolmo vůči optické ose objektivu mikroskopu, je optická pinzeta popsaná v užitném vzoru č. CZ 21642. Podstata optické pinzety spočívá v tom, že silové účinky fokusovaného laserového svazku zacíleného na mikrometrové objekty (živé i neživé) umožní prostorové zachycení těchto objektů. Tyto objekty jsou následně charakterizovány pomocí mikroskopu. </p>
    <p num="24"> </p>
    <p num="25">Uvedená optická pinzeta je v podstatě adaptér, který umožňuje snadné zavedení ultrafialového, viditelného a infračerveného záření do optické cesty mikroskopu. Tento adaptér zahrnuje hlavní část adaptéru a kovové, s výhodou invarové, těleso, které jsou vzájemně spojeny tak, že záření vycházející z kovového (invarového) tělesa je kolmé vůči optické ose mikroskopového objektivu, přičemž v hlavní části adaptéru je umístěno dichroidní zrcadlo, nakloněné vůči optické ose mikroskopového objektivu pod úhlem 45°, za dichroidním zrcadlem je umístěno skleněné okénko, svírající s optickou osou mikroskopového objektivu úhel 45° a zároveň s dichroidním zrcadlem úhel 90°, na spodní straně hlavní části adaptéru je přišroubován upevňovací šroub pro připojení adaptéru k tělu optického mikroskopu, k upevňovacímu šroubu je připevněn optický filtr blokující záření použitého zdroje záření a na vrchní straně hlavní části adaptéru je vlisována mosazná objímka se závitem pro připojení mikroskopového objektivu. Kovové (invarové) těleso zahrnuje zdroj záření a čočku, která je umístěna za zdrojem záření, blíže k hlavní části adaptéru. </p>
    <p num="26"> </p>
    <p num="27">Popsaná optická pinzeta umožňuje manipulaci s částicemi, ale nijak neřeší paralelní stanovení jejich vitality za různých podmínek, které je zásadní pro rychlou a přesnou identifikaci patogenů, popřípadě pro studium vlivu různých léčiv na jednotlivé skupiny patogenů. </p>
    <p num="28"> </p>
    <p num="29"> </p>
    <p num="30">Podstata technického řešení </p>
    <p num="31"> </p>
    <p num="32">Výše popsané nevýhody řeší mikrofluidní čip, který obsahuje mikrofluidní kanály a k nim připojené komory. Studované patogeny jsou ke komorám přiváděny uvedenými mikrofluidními kanály a do jednotlivých komor mohou být transportovány výše popsanou optickou pinzetou. Při jednom měření je možné použít více nezávislých komor, do kterých je možné vložit jak stejné tak i rozdílné druhy bakterií a následně je všechny ovlivňovat stejným typem a koncentrací antibiotik. </p>
    <p num="33"> </p>
    <p num="34">Mikrofluidní čip je umístěný na podstavě, která je umístěna kolmo k ose objektivu optického mikroskopu, ke kterému je připojena výše popsaná optická pinzeta, a které dohromady tvoří analytickou sestavu. Mikroskopovým objektivem je svazek záření přiveden do mikrofluidního čipu a slouží k výběru a zachycení požadovaných buněk. </p>
    <p num="35"> </p>
    <p num="36">Předkládané technické řešení umožňuje neinvazivní a nedestruktivní detekci a další charakterizaci mikrobů a jejich citlivosti, případně rezistence vůči antimikrobiálním látkám, a to přímo z lidských tělesných tekutin (krev, sliny apod.). V porovnání s jinými dostupnými metodami dokáže analytická sestava pracovat s nízkým množstvím mikrobů ve vzorku, dokáže identifikovat velké množství možných patogenů a její provoz je relativně levný. </p>
    <p num="37"> </p>
    <p num="38">Předmětem předkládaného technického řešení je tedy mikrofluidní čip pro mikroskopickou analýzu, který obsahuje centrální kanál, opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem, připojeným ke vstupnímu otvoru pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem, připojeným k výstupnímu otvoru pro kapalné médium. Počet vstupních a výstupních kanálků je variabilní podle účelu mikroskopické analýzy. V jednom provedení může mikrofluidní čip obsahovat až 10 vstupních a až 10 výstupních kanálků, umístěných na opačných koncích mikrofluidního čipu. </p>
    <p num="39"> </p>
    <p num="40">Centrální kanál je v jedné své části uspořádán do meandru, který slouží k promíchání protékající kapaliny. Meandrem se rozumí několik (typicky 3 až 5) půlkruhových zatáček centrálního kanálu, kde dochází změnou rychlostí kapaliny na vnitřní a vnější straně oblouku k promíchání a homogenizaci postupující kapaliny. Poloměr půlkruhové zatáčky centrálního kanálu je s výhodou v rozmezí od 100 µm do 500 µm. </p>
    <p num="41"> </p>
    <p num="42">Mezi meandrem centrálního kanálu a výstupním kanálkem je k centrálnímu kanálu připojen alespoň jeden boční kanálek opatřený na svém konci mikrokomorou. Ta slouží k umístění testovaného vzorku, například buněk. Centrálním kanálem a bočním kanálkem je při mikroskopické analýze k testovanému vzorku přiváděno kapalné médium obsahující testované sloučeniny a kombinace. Počet bočních kanálků může být od 1 do několika desítek, například od 1 do 50. </p>
    <p num="43"> </p>
    <p num="44">Všechny kanálky mikrofluidního čipu, s vyjímkou vstupních a výstupních otvorů, jsou po celé své délce uzavřeny vzduchotěsnou a kapalinotěsnou vrstvou. </p>
    <p num="45"> </p>
    <p num="46">Mikrofluidní čip je vyrobený z opticky čistého materiálu. Opticky čistým materiálem se rozumí materiál, který má velmi malé množství nečistot a defektů, což umožňuje volný průchod světla bez výrazného rozptylu nebo absorpce. </p>
    <p num="47"> </p>
    <p num="48">Mikrofluidní čip má s výhodou takové rozměry, aby byl kompatibilní s laboratorním mikroskopem. S výhodou má mikrofluidní čip rozměry plochy krycího nebo podložního sklíčka mikroskopu. V jednom provedení jsou rozměry mikrofluidního čipu v rozmezí od 20 mm x 40 mm x 0,5 mm do 26 mm x 76 mm x 10 mm.  </p>
    <p num="49"> </p>
    <p num="50">V jednom konkrétním provedení mají vstupní a výstupní kanálky s výhodou obdélníkový průřez 250 µm x 20 µm. Jednotlivé vstupní kanálky se postupně spojují do centrálního kanálu o stejném průřezu. Centrální kanál se dále s výhodou ještě před meandrem zúží, s výhodou na průřez 100 µm x 20 µm. Za meandrem z centrálního kanálu odbočuje několik (jednotky až desítky) bočních kanálků, s výhodou o průřezu 20 µm x 20 µm a s výhodou o délce 50 µm, které jsou zakončeny válcovou mikrokomorou, s výhodou o průměru 150 µm. </p>
    <p num="51"> </p>
    <p num="52">Regulací toku kapalného média ve vstupních kanálcích je možné přesně a rychle měnit koncentraci látek (například koncentraci antibiotik) v mikrokomoře. </p>
    <p num="53"> </p>
    <p num="54">V jednom provedení je mikrofluidní čip vyrobený z opticky čistého materiálu, vybraného ze skupiny zahrnující polydimethylsiloxan (PDMS), polymethylmethakrylát a sklo. Příprava mikrofluidních čipů z polymethylmethakrylátu nebo skla je však výrazně náročnější a to jak po přístrojové, chemické, finanční i časové stránce, nežli příprava mikročipů z PDMS. S výhodou je tedy materiálem mikrofluidního čipu PDMS. </p>
    <p num="55"> </p>
    <p num="56">V jednom provedení může být mikrofluidní čip vyroben metodou „soft lithography“ (měkká litografie), odléváním na masku z SU-8 vytvořenou UV litografií na křemíkovou destičku. Na mikrofluidním čipu jsou měkkou litografií vytvořeny kanálky. Reliéfní kanálek je následně uzavřen vzduchotěsným a kapalino těsným přilepením krycího sklíčka, s výhodou plasmatickou aktivací, které tuto strukturu uzavře a je dostatečně opticky vhodné pro následné měření a případnou manipulaci optickou pinzetou. </p>
    <p num="57"> </p>
    <p num="58">Kanálky mají s výhodou obdélníkový nebo čtvercový průřez, tento tvar je jednodušší vytvořit metodou litografie než kanálek o kruhovém či půlkruhovém průřezu (tyto typy kanálků se vyrábějí spíše chemickým leptáním). Další výhodou čtvercového nebo obdélníkového průřezu kanálku je, že nezkresluje obraz, protože horní i spodní plocha jsou rovnoběžné a rovinné. Válcová plocha by tvořila jakousi čočku a kazila by obraz měřené bakterie a mohla by deformovat svazek optické pinzety. Výhodou je i to, že v případě čtvercového/obdélníkového průřezu se nebude příliš měnit rovina zaostření objektivu při pozorování bakterií a bakterie budou plavat kanálkem přibližně ve stejné vzdálenosti od krycího skla a bude jednodušší je zachytit optickou pinzetou a změřit jejich spektrum. </p>
    <p num="59"> </p>
    <p num="60">Samotný centrální kanál je opatřen vstupními a výstupními kanálky, s výhodou obdélníkového průřezu o rozměrech 250±50 µm x 25±10 µm, které jsou připojené ke vstupním a výstupním otvorům pro kapalné médium, které je do/z nich přiváděno/odváděno pomocí hadiček. Jednotlivé vstupní kanálky se postupně spojují do jednoho centrálního kanálu o stejném průřezu. Centrální kanál se následně zúží alespoň na polovinu své původní šířky, s výhodou se centrální kanál zúží na 30 až 50 % své původní šířky. V jednom provedení se centrální kanál zúží do kanálku o průřezu 100±20 µm x 25±10 µm. </p>
    <p num="61"> </p>
    <p num="62">V další části je zúžený centrální kanál uspořádán do meandru (jedná se o 3 až 5 půlkruhových zatáček kanálku), kde dochází změnou rychlostí kapaliny na vnitřní a vnější straně oblouku k promíchání kapaliny, která se jinak pohybuje pouze laminárně a k mísení dochází pouze difúzí) zamíchá a homogenizuje. </p>
    <p num="63"> </p>
    <p num="64">Z centrálního kanálu za meandrem odbočuje několik (jednotky až desítky) bočních kanálků, s výhodou obdélníkového průřezu o rozměrech 25±10 µm x 25±10 µm o délce 50±20 µm, z nichž každý je zakončen mikrokomorou, s výhodou válcového tvaru, výhodněji o průměru 150±50 µm a výšce 25±10 µm. Veškeré kapaliny, jak vstupní tak i výstupní, jsou přivedeny do mikrofluidního čipu pomocí hadiček. </p>
    <p num="65"> </p>
    <p num="66">Mikrokomory jsou určené pro umístění vzorku. Výše uvedené výhodné rozměry mikrokomor umožňují zkoumaní i velmi malého množství vzorku (například buněk). Díky mikrokomorám v mikrofluidním čipu je možné vystavovat buňky stresovým faktorům, včetně antimikrobiálních látek, v uzavřeném prostředí. </p>
    <p num="67"> </p>
    <p num="68">Mikrokomora má s výhodou objem v rozmezí od 100 do 1100 mm3, výhodněji je ve tvaru válce o průměru 150±50 µm a výšce 25±10 µm. </p>
    <p num="69"> </p>
    <p num="70">Předmětem předkládaného technického řešení je dále analytická sestava pro charakterizaci a identifikaci mikrobů pomocí optických detekčních metod, která obsahuje výše popsaný mikrofluidní čip, umístěný na podstavě, která je svou rovinou v podstatě kolmá vůči optické ose objektivu mikroskopu. </p>
    <p num="71"> </p>
    <p num="72">Ve výhodném provedení je rovina podstavy (a tedy i v ní umístěného mikrofluidního čipu) nastavitelná vůči optické ose objektivu mikroskopu, který je osazen optickou pinzetou popsanou v CZ 21642. Pro optickou pinzetu je potřeba objektivů s vysokou numerickou aperturou (větší než 1, s výhodou je numerická apertura v rozmezí od 1,2 do 1,3). Pracovní vzdálenost těchto objektivů je v rozmezí mezi 0,2 mm a 0,5 mm. Vzdálenost mezi objektivem mikroskopu a mikrofluidním čipem umístěným na podstavě je v témže rozmezí mínus tloušťka krycího skla (0,15 mm ± 0,05 mm). </p>
    <p num="73"> </p>
    <p num="74">Ve výhodném provedení je podstavou tříosý stolek, s výhodou tříosý řiditelný stolek, který umožňuje naklápění mikrofluidního čipu vůči ose objektivu mikroskopu a tím paralelizovat měření rychlým přesunem kapaliny mezi jednotlivými komorami. Je tak možné měřit více vzorků najednou, každý v jiné mikrokomoře, což značně urychluje měření. </p>
    <p num="75"> </p>
    <p num="76">V jednom provedení je mikroskop připojen k Ramanovu spektrometru. Toto uspořádání umožňuje studium vitality bakterií pomocí Ramanovy spektroskopie. V jednom uspořádání je mikroskop součástí Ramanova spektrometru, respektive optická pinzeta a mikrofluidní čip jsou vloženy do Ramanovského mikroskopu tak, že se optická pinzeta našroubuje mezi tělo mikroskopu a mikroskopový objektiv a mikrofluidní čip se vloží do řiditelného stolku mikroskopu. </p>
    <p num="77"> </p>
    <p num="78">Optická pinzeta je popsána v užitném vzoru č. CZ 21642. Jedná se o adaptér, který umožňuje snadné zavedení ultrafialového, viditelného a infračerveného záření do optické cesty mikroskopu. Tento adaptér zahrnuje hlavní část adaptéru a kovové těleso, které jsou vzájemně spojeny tak, že záření vycházející z kovového tělesa je kolmé vůči optické ose mikroskopového objektivu, přičemž v hlavní části adaptéru je umístěno dichroidní zrcadlo, nakloněné vůči optické ose mikroskopového objektivu pod úhlem 45°, za dichroidním zrcadlem je umístěno skleněné okénko, svírající s optickou osou mikroskopového objektivu úhel 45° a zároveň s dichroidním zrcadlem úhel 90°, na spodní straně hlavní části adaptéru je přišroubován upevňovací šroub pro připojení adaptéru k tělu optického mikroskopu, k upevňovacímu šroubu je připevněn optický filtr blokující záření použitého zdroje záření a na vrchní straně hlavní části adaptéru je vlisována mosazná objímka se závitem pro připojení mikroskopového objektivu. Uvedené kovové těleso je s výhodou z invarového materiálu a zahrnuje zdroj záření a čočku, která je umístěna za zdrojem záření, blíže k hlavní části adaptéru. </p>
    <p num="79"> </p>
    <p num="80">Optická pinzeta obsahuje jeden chytací a druhý analyzační laserový paprsek. Optická pinzeta slouží pro výběr a zachycení požadovaného vzorku, umožňuje bezkontaktní transport tohoto vzorku do mikrokomory a jeho analýzu Ramanovou spektroskopií s využitím jednoho chytacího a druhého analyzačního laserového svazku. </p>
    <p num="81"> </p>
    <p num="82">V objektivu mikroskopu jsou chytací laserový svazek a analyzační laserový svazek optické pinzety přivedeny do mikrofluidního čipu. </p>
    <p num="83"> </p>
    <p num="84">Hadičky během provozu analytické sestavy přivádějí do vstupních otvorů mikrofluidního čipu veškeré vstupní kapaliny a odvádějí veškeré výstupní kapaliny z výstupních otvorů mikrofluidního čipu. Ve výhodném provedení jsou používány dva typy hadiček. Tenké hadičky o vnějším průměru 360±20 µm a vnitřním průměru 140±20 µm vyrobené z materiálu PEEK a hadičky o vnějším průměru 1,5±0,1 mm a vnitřním průměru od 0,1 mm do 1 mm, tyto hadičky mohou být vyrobené též z PEEKu nebo z teflonu. </p>
    <p num="85"> </p>
    <p num="86">Tenké hadičky se používají pro přívod kapalných vzorků do čipu z důvodu nutnosti přesnější manipulace s průtoky kapalin a jejich průměr bývá lépe definovaný, silnější hadičky slouží spíše k odvodu kapaliny z čipu. Mají zpravidla větší vnitřní průřezy, aby nedocházelo k jejich ucpávání. </p>
    <p num="87"> </p>
    <p num="88">Krycí sklíčko slouží k uzavření profilu mikrofluidního kanálku, který je po odlití nebo otištění z masky tvořen otevřeným reliéfem v opticky čistém materiálu mikrofluidního čipu (plastu nebo skle) a je potřeba ho překrýt. Je vhodné použít krycí sklíčko, protože má optické a rozměrové vlastnosti vhodné a potřebné pro použití optické pinzety. Lze použít i jiné materiály, ale jejich tloušťka nesmí být větší než je pracovní vzdálenost mikroskopového objektivu s vyšší numerickou aperturou a to je 0,15 mm až 0,5 mm. V jednom provedení je pracovní vzdálenost optické pinzety od krycího sklíčka v rozmezí od 0 do 100 µm. </p>
    <p num="89"> </p>
    <p num="90">Během provozu analytické sestavy jsou hadičkami do mikrofluidního čipu přiváděny vstupní kapaliny. Vzorek (například mikroby v nosném médiu) je přiváděn vstupním kanálkem, centrálním kanálem a následně je bočním kanálkem transportován do mikrokomory prostřednictvím optické pinzety. Optická pinzeta obsahuje jeden chytací a druhý analyzační laserový paprsek. Díky tomu je možné vybrat a zachytit požadovaný vzorek, bezkontaktně transportovat tento vzorek do mikrokomory a analyzovat jej například Ramanovou spektroskopií s využitím Ramanova spektrometru. Po vyčištění centrálního kanálu od zbytků vzorků (mikrobů) jsou s výhodou vstupními kanálky, dále centrálním kanálem a následně bočními kanálky do mikrokomory prostřednictvím optické pinzety přiváděny další látky, jejichž vliv na vzorek může být zkoumán (například roztok antibiotik a média). Koncentrace těchto látek v mikrokomoře může být ovlivňována změnou rychlosti toku kapaliny ve vstupních kanálcích. Vzorky jsou následně měřeny Ramanovou spektroskopií s využitím Ramanova spektrometru. </p>
    <p num="91"> </p>
    <p num="92">Záření nepružně rozptýlené zachyceným vzorkem (Ramanův rozptyl) nese informaci o molekulárních vazebných vibracích ve vzorku a napomáhá určit jeho chemické složení s mikrometrovým prostorovým rozlišením. Jediný laserový svazek tak umožní bezkontaktně a sterilně zachytit vzorky v kapalině a současně je diagnostikovat, aniž by byla poškozena jejich struktura nebo fyziologie. Vlnová délka je volena tak, aby nedocházelo k absorpci záření, a tím i k destrukci vzorku a současně, aby byl Ramanův rozptyl detekovatelný. Pro živé mikroorganismy je vhodné volit delší vlnové délky (700 až 900 nm). Při takto zvolené vlnové délce, je možné požadovaný vzorek sledovat i několik hodin (tzv. časosběrná měření) nebo naopak sledovat velmi rychlé dynamické procesy. </p>
    <p num="93"> </p>
    <p num="94">Analytickou sestavu podle předkládaného technického řešení lze s výhodou použít pro měření vlivu antibiotik na bakterie, při němž jsou bakterie uchovávány v mikrokomorách a jejich vitalita je měřena prostřednictvím různých detekčních metod, např. fluorescence, Ramanovy spektroskopie, atd. </p>
    <p num="95"> </p>
    <p num="96">Koncentrace antibiotik se mění v závislosti na rychlosti toku média s antibiotiky ve vstupních kanálcích. Vitalita bakterií se měří například Ramanovou spektroskopií a hledá se koncentrace a typ antibiotik, které dané bakterie zabíjejí. Při jednom měření je možné použít více nezávislých mikrokomor, do kterých je možné vložit jak stejné, tak i rozdílné druhy bakterií a následně tyto rozdílné druhy bakterií ovlivňovat stejným typem a koncentrací antibiotik. </p>
    <p num="97"> </p>
    <p num="98">Předkládané technické řešení umožňuje rychlé, bezkontaktní a šetrné měření Ramanova spektra živých i neživých vzorků (například bakteriálních buněk). Měření je nedestruktivní, bakteriální buňky měření přežijí, a je tedy možné je využít pro následné analýzy. </p>
    <p num="99"> </p>
    <p num="100"> </p>
    <p num="101">Objasnění výkresů </p>
    <p num="102"> </p>
    <p num="103">Obrázek 1: Axonometrický pohled na analytickou sestavu. </p>
    <p num="104">Obrázek 2: Boční pohled na analytickou sestavu. </p>
    <p num="105">Obrázek 3: Nákres mikrofluidního čipu a schéma kanálu 6. </p>
    <p num="106"> </p>
    <p num="107"> </p>
    <p num="108">Příklad uskutečnění technického řešení </p>
    <p num="109"> </p>
    <p num="110">Byla sestrojena analytická sestava pro charakterizaci a identifikaci mikrobů Ramanovou spektroskopií podle obrázků 1 a 2. Analytická sestava obsahuje mikrofluidní čip 2, z jehož horní strany po bocích vystupují hadičky 3 z materiálu PEEK a který je svou spodní stranou uložený na řiditelném tříosém stolku, sloužícím jako podstava 4, který je umístěn na horní části objektivu 5 mikroskopu (s numerickou aperturou 1,3), který je dále svou spodní částí připojen k optické pinzetě 7 dle CZ 21642. Objektivem 5 mikroskopu jsou chytací a analytické laserové svazky optické pinzety 7 přivedeny do mikrofluidního čipu 2. Mikroskop je součástí Ramanova spektrometru, optická pinzeta 7 a mikrofluidní čip 2 jsou vloženy do Ramanovského mikroskopu tak, že optická pinzeta 7 se našroubuje mezi tělo mikroskopu a mikroskopový objektiv 5 a mikrofluidní čip 2 (obrázek 3) se vloží do řiditelného stolku mikroskopu. </p>
    <p num="111"> </p>
    <p num="112">Mikrofluidním čipem 2 (obrázek 3) prostupuje centrální kanál 6, k němuž jsou připojeny vstupní 6.1, výstupní 6.2 a boční kanálky 12. Vstupní a výstupní kanálky mají obdélníkový průřez 250 µm x 20 µm. Jednotlivé vstupní kanálky se postupně spojují do centrálního kanálu 6 o průřezu 250 µm x 20 µm. Centrální kanál 6 se dále zužuje na průřez 100 µm x 20 µm a jím procházející kapalný obsah se následně v meandru 11 zamíchá a homogenizuje. Meandr 11 obsahuje 5 půlkruhových zatáček o poloměru 125 µm. Z centrálního kanálu 6 odbočuje 10 bočních kanálků 12 o průřezu 20 µm x 20 µm a o délce 50 µm, které jsou zakončeny válcovými mikrokomorami o průměru 150 µm a výšce 20 µm. </p>
    <p num="113"> </p>
    <p num="114">Mikrofluidní čip 2 byl vyroben metodou měkké litografie, odléváním na masku z SU-8 vytvořenou UV litografií na křemíkovou destičku. Na mikrofluidním čipu 2 byly měkkou litografií z PDMS vytvořeny reliéfní kanálky, které byly následně uzavřeny vzduchotěsným a kapalino těsným přilepením krycího sklíčka plasmatickou aktivací. </p>
    <p num="115"> </p>
    <p num="116">Během provozu analytické sestavy jsou hadičkami 3 do mikrofluidního čipu 2 přiváděny vstupní i výstupní kapaliny. Vzorek (například mikroby v nosném médiu) je přiváděn vstupním kanálkem 6.1, dále centrálním kanálem 6 a následně je bočním kanálkem 12 transportován do mikrokomory 11 prostřednictvím optické pinzety 7. Optická pinzeta 7 obsahuje jeden chytací a druhý analyzační laserový paprsek. Díky tomu je možné vybrat a zachytit požadované vzorky, bezkontaktně transport tyto vzorky do mikrokomory a analyzovat je Ramanovou spektroskopií s využitím Ramanova spektrometru. Následuje vyčištění centrálního kanálu 6 od zbytků vzorků a přivedení dalších látek, jejichž vliv na vzorek může být zkoumán, vstupním kanálkem, dále centrálním kanálem 6 a následně transport bočním kanálkem do mikrokomory prostřednictvím optické pinzety 7. Koncentrace těchto látek v mikrokomoře může být ovlivňována změnou rychlosti toku kapaliny ve vstupních kanálcích. Vzorky jsou následně měřeny Ramanovou spektroskopií s využitím Ramanova spektrometru. Řiditelný tříosý stolek sloužící jako podstava 4 umožňuje paralelizaci měření rychlým přesunem mezi jednotlivými mikrokomorami. Je tak možné měřit více vzorků najednou, každý v jiné mikrokomoře, což značně urychluje měření. Velice malé rozměry mikrokomory umožňují zkoumaní i velmi malého množství vzorku (například bakteriálních buněk). </p>
    <p num="117"> </p>
    <p num="118"> </p>
    <p num="119">Průmyslová využitelnost </p>
    <p num="120"> </p>
    <p num="121">Uplatnění tohoto zařízení může být jak ve výzkumu, tak i v klinické diagnostice, či jiných aplikacích, kde je potřeba zkoumat bakterie na úrovni jednotlivých buněk, případně kde je žádoucí jejich kultivace v kontrolovaném mikroprostředí, včetně vystavování různým stresovým faktorům (změna teploty nebo koncentrace různých látek). </p>
    <description-of-drawings>
      <p num="1">    1 – krycí sklíčko
  <br/>    2 – mikrofluidní čip
  <br/>    3 – hadička
  <br/>    4 – podstava
  <br/>    5 – objektiv mikroskopu
  <br/>    6 – centrální kanál
  <br/>    6.1 – vstupní kanálek
  <br/>    6.2 – výstupní kanálek
  <br/>    7 – optická pinzeta
  <br/>    8 – vstupní otvor
  <br/>    9 – výstupní otvor
  <br/>    10 – mikrokomora
  <br/>    11 - meandr
  <br/>    12 – boční kanálek
 </p>
    </description-of-drawings>
  </description>
  <claims id="claim">
    <claim num="1">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, 
   <b>vyznačený tím</b>, že obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z opticky čistého materiálu.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="2">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) podle nároku 1, 
   <b>vyznačený tím</b>, že centrální kanál (6) a boční kanálek (12) mají čtvercový nebo obdélníkový průřez.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="3">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 2, 
   <b>vyznačený tím</b>, že je vyrobený z polydimethylsiloxanu, polymethylmethakrylátu a/nebo skla, s výhodou je vyrobený z polydimethylsiloxanu.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="4">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, 
   <b>vyznačený tím</b>, že obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z opticky čistého materiálu;a přičemž centrální kanál (6) a boční kanálek (12) mají čtvercový nebo obdélníkový průřez;a přičemž meandr (11) sestává ze třech až pěti půlkruhových zatáček centrálního kanálu (6).
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="5">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) podle nároku 4, 
   <b>vyznačený tím</b>, že půlkruhové zatáčky meandru (11) centrálního kanálu (6) mají poloměr v rozmezí od 100 µm do 500 µm.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="6">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, 
   <b>vyznačený tím</b>, že obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z polydimethylsiloxanu;a přičemž centrální kanál (6) a boční kanálek (12) mají čtvercový nebo obdélníkový průřez;a přičemž meandr (11) sestává ze třech až pěti půlkruhových zatáček centrálního kanálu (6), přičemž průřez centrálního kanálu (6) má rozměry od 100 x 15 µm do 300 x 35 µm a půlkruhové zatáčky centrálního kanálu (6) mají poloměr v rozmezí od 100 µm do 500 µm.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="7">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, 
   <b>vyznačený tím</b>, že obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z polydimethylsiloxanu a má tvar kvádru o rozměrech v rozmezí od 20 mm x 40 mm x 0,5 mm do 26 mm x 76 mm x 10 mm;a přičemž centrální kanál (6) má obdélníkový průřez o rozměrech od 100 x 15 µm do 300 x 35 µm;a přičemž boční kanálek (12) má čtvercový nebo obdélníkový průřez o rozměrech 25±10 µm x 25±10 µm a délka bočního kanálku (12) je v rozmezí od 30 do 70 µm;a přičemž meandr (11) sestává ze třech až pěti půlkruhových zatáček centrálního kanálu (6), které mají poloměr v rozmezí od 100 µm do 500 µm.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="8">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, 
   <b>vyznačený tím</b>, že obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z polydimethylsiloxanu, polymethylmethakrylátu a/nebo skla a má tvar kvádru o rozměrech 
   <br/>v rozmezí od 20 mm x 40 mm x 0,5 mm do 26 mm x 76 mm x 10 mm;a přičemž centrální kanál (6) má obdélníkový průřez o rozměrech od 100 x 15 µm do 300 x 35 µm;a přičemž boční kanálek (12) má čtvercový nebo obdélníkový průřez o rozměrech 25±10 µm x 25±10 µm a délka bočního kanálku (12) je v rozmezí od 30 do 70 µm;a přičemž meandr (11) sestává ze třech až pěti půlkruhových zatáček centrálního kanálu (6), které mají poloměr v rozmezí od 100 µm do 500 µm;a přičemž mikrofluidní čip (2) je ve formě reliéfu z polydimethylsiloxanu, jehož vystupující plocha je vzduchotěsně a kapalinotěsně uzavřena krycím sklem (1).
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="9">
      <claim-text>Mikrofluidní čip (2) podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8, 
   <b>vyznačený tím</b>, že mikrokomora (10) má objem v rozmezí od 100 do 1100 mm
   <sup>3</sup>.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="10">
      <claim-text>Analytická sestava pro charakterizaci a identifikaci mikrobů pomocí optických detekčních metod, 
   <b>vyznačená tím</b>, že obsahuje:- Ramanův mikroskop,- optickou pinzetu (7) pro výběr, zachycení a transport požadovaného vzorku do mikrokomory (10), která je umístěna mezi tělem a objektivem (5) Ramanova mikroskopu, a přičemž analytická sestava je uzpůsobena pro přivedení chytacího laserového svazku a analyzačního laserového svazku optické pinzety (7) skrze objektiv (5) mikroskopu do mikrofluidního čipu (2);- mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, umístěný na podstavě (4), která je svou rovinou v podstatě kolmá vůči optické ose objektivu (5) mikroskopu; přičemž mikrofluidní čip (2) obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z opticky čistého materiálu.
  </claim-text>
    </claim>
    <claim num="11">
      <claim-text>Analytická sestava pro charakterizaci a identifikaci mikrobů pomocí optických detekčních metod, 
   <b>vyznačená tím</b>, že obsahuje:- Ramanův mikroskop, jehož objektiv (5) má numerickou aperturu větší než 1;- optickou pinzetu (7) pro výběr, zachycení a transport požadovaného vzorku do mikrokomory (10), která je umístěna mezi tělem a objektivem (5) Ramanova mikroskopu, a přičemž analytická sestava je uzpůsobena pro přivedení chytacího laserového svazku a analyzačního laserového svazku optické pinzety (7) skrze objektiv (5) mikroskopu do mikrofluidního čipu (2);- mikrofluidní čip (2) pro mikroskopickou analýzu, umístěný na tříosém řiditelném stolku, uzpůsobeném pro naklápění mikrofluidního čipu (2) vůči ose objektivu (5) mikroskopu, která je svou rovinou v podstatě kolmá vůči optické ose objektivu (5) mikroskopu; přičemž mikrofluidní čip (2) obsahuje:- centrální kanál (6), opatřený na jednom konci alespoň jedním vstupním kanálkem (6.1), připojeným ke vstupnímu otvoru (8) pro kapalné médium, a na druhém konci alespoň jedním výstupním kanálkem (6.2), připojeným k výstupnímu otvoru (9) pro kapalné médium;přičemž centrální kanál (6) je v jedné své části uspořádán do meandru (11) pro promíchání kapaliny;a přičemž mezi meandrem (11) centrálního kanálu (6) a výstupním kanálkem (6.2) je k centrálnímu kanálu (6) připojen alespoň jeden boční kanálek (12) opatřený na svém konci mikrokomorou (10);přičemž mikrofluidní čip je vyrobený z polydimethylsiloxanu, polymethylmethakrylátu a/nebo skla a má tvar kvádru o rozměrech 
   <br/>​​​​​​​v rozmezí ​​​​od 20 mm x 40 mm x 0,5 mm do 26 mm x 76 mm x 10 mm;a přičemž centrální kanál (6) má obdélníkový průřez o rozměrech od 100 x 15 µm do 300 x 35 µm;a přičemž boční kanálek (12) má čtvercový nebo obdélníkový průřez o rozměrech 25±10 µm x 25±10 µm a délka bočního kanálku (12) je v rozmezí od 30 do 70 µm;a přičemž meandr (11) sestává ze třech až pěti půlkruhových zatáček centrálního kanálu (6), které mají poloměr v rozmezí od 100 µm do 500 µm;a přičemž mikrofluidní čip (2) je ve formě reliéfu z polydimethylsiloxanu, jehož vystupující plocha je vzduchotěsně a kapalinotěsně uzavřena krycím sklem (1).
  </claim-text>
    </claim>
  </claims>
  <drawings id="draw">
    <figure num="1">
      <img file="2502882img0001.jpg" img-content="drawing" img-format="jpg" wi="450" he="500"/>
    </figure>
    <figure num="2">
      <img file="2502882img0002.jpg" img-content="drawing" img-format="jpg" wi="470" he="500"/>
    </figure>
    <figure num="3">
      <img file="2502882img0003.jpg" img-content="drawing" img-format="jpg" wi="500" he="245"/>
    </figure>
  </drawings>
</ep-patent-document>
